《Frontiers in Immunology》：Long-term high-fat diet and long-term high-refined-carbohydrate diet induce alterations in the splenic TCRβ CDR3 repertoire and peripheral multi-compartmental immune parameters in mice
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摘要
背景： 高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）和高精制碳水化合物饮食（High-Refined Carbohydrate Diet, HRCD）与慢性炎症、自身免疫性疾病及感染性疾病风险的升高密切相关。然而，长期干预这两种饮食后免疫系统的分子改
摘要
背景： 高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）和高精制碳水化合物饮食（High-Refined Carbohydrate Diet, HRCD）与慢性炎症、自身免疫性疾病及感染性疾病风险的升高密切相关。然而，长期干预这两种饮食后免疫系统的分子改变仍不清楚。
方法： 以3月龄年轻雄性小鼠为动物模型，接受HFD或HRCD长期干预至14月龄。对免疫器官的病理特征、免疫细胞亚群、血清蛋白质组学以及通过下一代测序检测的TCRβ CDR3组库特征进行比较分析。
结果： 两种饮食干预均导致小鼠体重增加，并引起相似的脾脏病理损伤。其对免疫系统的影响以外周改变为主，中枢改变较为轻微。同时，两种饮食均导致脾脏TCRβ CDR3组库克隆集中度增加、均匀度降低、低频克隆耗竭及中频克隆扩张，并鉴定出一个克隆型CSSRAGGLNSDYTF，其在HFD和HRCD组的胸腺和脾脏中的丰度均显著高于对照组。相比之下，两种饮食调节免疫的具体机制存在显著差异。HFD显著上调血清IL-6、IL-10、TNF-α和FAS水平，改变脾脏T细胞亚群比例，并强烈影响脾脏TRBJ基因使用和CDR3长度分布。HRCD主要增加IL-17A水平和树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）比例。
结论： 本研究初步证明HFD和HRCD可诱导相似的病理表型但不同的分子免疫机制，两者在所检测参数下均显示脾脏的改变比胸腺更为显著。
长期高脂饮食与高精制碳水化合物饮食对小鼠免疫系统的差异化重塑：基于TCRβ CDR3组库与外周免疫参数的系统解析
一、研究背景与科学问题
现代饮食模式中，长期高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）和高精制碳水化合物饮食（High-Refined Carbohydrate Diet, HRCD）所引发的代谢稳态失衡已成为导致全身代谢紊乱和免疫功能受损的高危因素。不同饮食模式驱动的代谢紊乱可增加慢性低度炎症、自身免疫性疾病和感染性疾病的风险，并与衰老协同加速免疫衰老进程。既往研究已证实HFD对免疫系统的影响包括诱导脾脏氧化应激、显著促进脾脏淋巴细胞凋亡、破坏T细胞亚群平衡等；高精制碳水化合物饮食则可引起肠道菌群失调、脂肪组织免疫细胞浸润及炎症因子水平持续升高等。
T细胞受体β链互补决定区3（TCRβ CDR3）组库的多样性和特征是指示免疫应答特异性的关键指标，其改变是机体免疫功能状态的直接反映。然而，现有研究存在明显局限：干预周期普遍较短，从成年持续至中老年的长期模型（11个月）仍然稀缺；HFD和HRCD对中枢（胸腺）和外周（脾脏）免疫器官TCR组库的影响缺乏全面系统的分析；两种饮食差异化影响及其潜在机制的比较研究尚属空白。此外，HRCD对TCRβ CDR3组库特征的影响此前完全不清楚。
二、研究设计与技术方法
研究人员以3月龄雄性C57BL/6J小鼠为研究对象（购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，广东），随机分为三组（每组n=8）：高脂饮食组（HFD组，含60%脂肪）、高精制碳水化合物饮食组（HRCD组，含70%精制碳水化合物）和对照组（标准维持饲料，含63%碳水化合物、13%脂肪、24%蛋白质），持续干预11个月至14月龄。研究采用了以下关键技术方法：苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining, H&E）评估脾脏病理结构；免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）检测CD3?T细胞区分布；流式细胞术（Flow Cytometry）分析胸腺和脾脏免疫细胞亚群比例；Olink蛋白质组学技术检测血清蛋白表达谱；多重PCR扩增结合下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术（DNBSEQ-T7平台，双端150bp测序，每样本约1920万读段对）对胸腺和脾脏TCRβ CDR3组库进行高通量测序；生物信息学分析采用MiXCR处理原始数据、immunarch和VDJTools进行组库特征分析。
三、研究结果
3.1 HFD和HRCD改变了小鼠体重和血清细胞因子水平
三组小鼠日均热量摄入无显著差异（对照组14.11±0.54 kcal/天，HFD组14.40±0.30 kcal/天，HRCD组14.76±0.47 kcal/天），但HFD和HRCD组日均食物摄入量显著低于对照组。经11个月饮食干预后，HFD和HRCD组小鼠体型和体重均显著增加。血清检测显示，两组血清总胆固醇（Total Cholesterol, TC）和空腹血糖（Fasting Blood Glucose, FBG）水平均显著高于对照组，而甘油三酯（Triglyceride, TG）无显著差异。蛋白质组学分析显示，HFD组血清IL-6、IL-10、TNF-α和FAS蛋白水平显著升高；HRCD组血清IL-10、IL-17A、TNF-α和FAS水平显著升高。
3.2 HFD和HRCD改变了小鼠脾脏免疫细胞亚群比例
流式细胞术分析显示，胸腺中各免疫细胞亚群比例在两组饮食干预下均无显著变化。脾脏中，HFD组总T细胞、CD8?T细胞和NKT细胞比例均显著低于对照组；HRCD组脾脏树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）比例显著高于对照组。
3.3 HFD诱导小鼠脾脏病理改变
HFD组脾脏重量较对照组显著增加，HRCD组呈上升趋势但无统计学差异。H&E染色显示，HFD和HRCD组小鼠均出现白髓形态不规则、白髓与红髓交界模糊，HFD组改变更为显著。HFD组白髓比例和红髓/白髓比值（R/W ratio）均显著升高，HRCD组无显著差异。免疫组化显示三组脾脏白髓内CD3?T细胞区面积比例无统计学差异，但HFD和HRCD组均呈下降趋势。
3.4 HFD和HRCD小鼠脾脏TCRβ CDR3组库克隆集中度增加、均匀度降低
在胸腺中，HFD和HRCD组的D50多样性指数和反辛普森指数均无显著差异。在脾脏中，HFD组D50多样性指数较对照组显著降低；HRCD组无显著差异。反辛普森指数虽因标准差较大未达统计学显著，但HFD和HRCD组均呈明显下降趋势。
3.5 HFD和HRCD改变了小鼠胸腺和脾脏TCRβ CDR3组库克隆分布特征
研究人员将克隆型按频率分为低频（0< />< />< />< />
3.6 HFD和HRCD对小鼠胸腺和脾脏T细胞受体β可变区和连接区基因使用的影响不同
HFD组胸腺中TRBV12-1和TRBV5使用率升高、TRBJ1-5使用率降低；脾脏中TRBV12-1、TRBV23、TRBJ1-2和TRBJ2-1使用率升高，TRBV19、TRBV2、TRBV4、TRBJ2-3、TRBJ2-4、TRBJ2-5和TRBJ2-7使用率降低。HRCD组胸腺中TRBV12-1、TRBV31、TRBV5和TRBJ2-3使用率升高，TRBJ1-1、TRBJ1-3和TRBJ1-5使用率降低；脾脏中TRBV12-1和TRBV12-2使用率升高、TRBV13-1使用率降低，TRBJ基因使用无显著差异。
3.7 HFD和HRCD影响小鼠胸腺和脾脏CDR3长度分布但不改变长度峰值
两种饮食干预均未改变CDR3长度峰值，仍呈以14、15个氨基酸为中心的钟形分布。胸腺中，HFD组11个氨基酸CDR3比例升高，HRCD组8个和9个氨基酸CDR3比例升高。脾脏中，HFD组9、12和13个氨基酸CDR3比例降低，17、18、19、25和>25个氨基酸CDR3比例升高；HRCD组无显著差异。三组间胸腺和脾脏氨基酸使用无显著差异。
3.8 HFD和HRCD导致小鼠胸腺组内克隆型相似性高而脾脏个体差异显著
共享克隆型数和Jaccard指数分析显示，HFD和HRCD组胸腺Jaccard指数显著高于对照组；脾脏中三组Jaccard指数无显著差异，但标准差较胸腺增大，HFD组尤为明显。
3.9 HFD和HRCD可能诱导特定的差异丰度TCRβ CDR3克隆型作为饮食干预的特征序列
研究人员筛选出HFD组胸腺10个上调克隆型、脾脏8个上调克隆型；HRCD组胸腺10个上调克隆型、脾脏11个上调克隆型。其中克隆型"CSSRAGGLNSDYTF"在HFD和HRCD组的胸腺和脾脏中表达均显著高于对照组。
四、讨论与结论
讨论总结
研究结果表明，HFD和HRCD组小鼠食物摄入量虽显著降低但日均热量摄入相当，基本排除了热量过剩作为免疫系统改变的混杂变量。两种饮食均显著上调TNF-α（髓系来源炎症介质）、IL-10（免疫调节因子）和FAS（组织损伤和凋亡相关蛋白），但HFD以IL-6（T细胞相关因子）升高为主，HRCD以IL-17A（Th17细胞相关因子）升高为主，提示两种饮食可能激活炎症-免疫调节相关通路但优先级不同。胸腺作为相对隔离的微环境，免受全身代谢变化的直接影响，故免疫细胞亚群无显著改变；脾脏作为最大的次级淋巴器官，直接暴露于循环炎症因子，对免疫扰动更为敏感。HFD主要影响T细胞、CD8?T细胞和NKT细胞亚群，可能与长链饱和脂肪酸在CD8?T细胞内的积累直接损害T细胞代谢和功能有关；HRCD主要引起DC亚群比例升高，可能与其向促炎表型的成熟和极化增强有关。脾脏中减少的免疫细胞可能部分迁移至脂肪组织等炎症部位参与局部炎症反应。在TCR组库层面，两种饮食均诱导脾脏低频克隆耗竭和中频克隆扩张，但HFD效应更为显著。TRBV12-1在两种饮食的胸腺和脾脏中均呈一致性升高，可能与其克隆扩增或饮食应答相关的选择性偏好有关。HFD组脾脏CDR3长度向长CDR3偏移，可能与炎症微环境削弱MHC分子对CDR3长度的正常限制作用有关。新鉴定的克隆型CSSRAGGLNSDYTF在两种饮食的胸腺和脾脏中均显著升高，其具体功能有待后续验证。
结论翻译
本研究对3月龄雄性C57BL/6J小鼠进行长期HFD和HRCD干预直至14月龄。在对多项免疫相关参数进行系统分析后发现，HFD和HRCD可能通过不同的分子机制触发免疫紊乱。本研究为解析饮食组成对免疫系统的调节作用以及HFD和HRCD诱导免疫紊乱的发病机制提供了实验证据，并鉴定了潜在的生物标志物。
