双功能mXCL1-mCD40L mRNA佐剂通过协同cDC1募集与成熟增强实体瘤mRNA疫苗疗效

《Frontiers in Immunology》：A dual-function XCL1-CD40L mRNA adjuvant potentiates cancer vaccines by coordinating DC recruitment and maturation

**摘要**

**背景：** 尽管mRNA肿瘤疫苗在治疗实体瘤方面展现出显著前景，但其临床应答率受到肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中抗原提呈效率低下所制约。1型经典树突状细胞（conventional type 1 dendritic cells, cDC1）在抗原交叉提呈中起关键作用，然而，在实体恶性肿瘤中，它们常常表现出免疫活化通讯不足。

**方法：** 本研究通过TCGA队列和单细胞转录组数据全面检视了cDC1的功能特征。在这些生物信息学发现的指导下，研究人员设计并合成了编码mXCL1-mCD40L融合蛋白的双功能mRNA佐剂。通过蛋白表达、结构预测、体内抗原摄取与提呈检测、抗原提呈细胞活化检测、抗原特异性T细胞活化检测以及荷瘤小鼠模型中的治疗研究，评估了该佐剂联合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3, GPC3）及HPV相关mRNA疫苗的生物学功能和抗肿瘤疗效。

**结果：** 在LIHC和SKCM TCGA队列中，高cDC1特征评分与更好的总生存期相关。与正常样本相比，HCC和黑色素瘤中的cDC1保留了其抗原提呈机制，但接收到的活化配体输入减少（HCC中为XCL1-XCR1信号，黑色素瘤中为CD40-CD40L信号）。AlphaFold 3显示mXCL1-mCD40L融合蛋白可维持结构完整性且无空间位阻。该融合蛋白被证实可被分泌，并同时保留XCL1依赖的趋化活性和CD40依赖的树突状细胞活化功能。mXCL1-mCD40L mRNA-LNP在体外可活化巨噬细胞和树突状细胞，qPCR证实其上调免疫相关基因表达。在体内，该双功能佐剂显著增强了GPC3疫苗的抗肿瘤效果，优于单独递送mXCL1和mCD40L mRNA-LNP的联合给药方案，并诱导了更强的特异性产生IFN-γ的T细胞。同时，该佐剂也增强了HPV相关mRNA疫苗的抗肿瘤疗效。机制上，该佐剂增加了CD103⁺树突状细胞对肿瘤抗原的获取和交叉提呈，并促进了引流淋巴结中树突状细胞的成熟，同时伴随外周血CD8⁺ T细胞比例的增加。

**结论：** 通过增强cDC1的募集和成熟，双功能mXCL1-mCD40L mRNA佐剂提升了GPC3和HPV相关mRNA疫苗的疗效，支持其作为对抗实体瘤的抗原本地化（antigen-flexible）佐剂平台的潜力。

**论文解读：基于临床转录组学设计的双功能mXCL1-mCD40L mRNA佐剂增强实体瘤mRNA疫苗疗效**

**1. 研究背景与问题**

mRNA肿瘤疫苗在治疗实体瘤方面前景广阔，但其临床响应率受限于实体瘤免疫抑制性微环境（tumor microenvironment, TME）导致的抗原提呈效率低下。1型经典树突状细胞（conventional type 1 dendritic cells, cDC1）是交叉提呈肿瘤抗原、启动CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫的关键亚群。然而，在实体瘤中，cDC1常呈现功能障碍：其一，趋化因子信号不足或失调限制了cDC1的定位与滞留；其二，TME中的缺氧和免疫抑制网络损害了cDC1的成熟，下调共刺激分子，削弱了有效的抗原提呈和T细胞活化。这两个缺陷共同构成了mRNA疫苗疗效的核心障碍，而现有佐剂未能同时解决这两个瓶颈问题。

**2. 研究内容与结论**

针对上述未满足的临床需求，研究人员提出假设：同时靶向cDC1的趋化募集和功能成熟，可以增强实体瘤TME中cDC1相关的免疫活化，并显著提升mRNA疫苗的抗肿瘤疗效。为验证该假设，研究人员首先整合TCGA和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，系统剖析了肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）和黑色素瘤中cDC1的功能异常及分子机制。基于这些发现，设计并构建了编码小鼠XCL1-mCD40L（mXCL1-mCD40L）融合蛋白的双功能mRNA佐剂，并对其体外免疫激活活性、体内联合GPC3 mRNA疫苗的抗肿瘤疗效及机制进行了系统评估。

研究结论表明，双功能mXCL1-mCD40L mRNA佐剂通过同时恢复cDC1的募集与成熟信号，显著增强了GPC3和HPV相关mRNA疫苗在实体瘤小鼠模型中的治疗 Efficacy，并支持其作为抗原灵活的佐剂平台。该研究为克服mRNA疫苗在实体瘤中的疗效瓶颈提供了基于临床数据驱动的合理设计策略。

**3. 主要关键技术方法**

研究人员运用以下关键技术方法开展研究：
- **生物信息学分析**：利用TCGA-LIHC和TCGA-SKCM队列进行cDC1特征评分与生存分析；整合GEO数据库的scRNA-seq数据（HCC：GSE166635, GSE282701, GSE242889，包含13个肿瘤和11个癌旁组织；黑色素瘤：GSE221390, GSE277165，包含12个肿瘤和3个痣），经Seurat、Harmony和DoubletFinder处理，并运用CellChat进行细胞通讯分析。
- **mRNA设计与合成**：构建编码mXCL1-mCD40L融合蛋白的mRNA，通过体外转录合成含N1-甲基假尿苷修饰和Cap 1结构的mRNA，并包装为脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）。
- **蛋白结构预测**：采用AlphaFold 3预测融合蛋白的三级结构和三聚体组装。
- **功能验证**：结合ELISA、Transwell趋化实验、流式细胞术、qPCR以及小鼠肿瘤模型（B16F10-hGPC3, B16-OVA, TC-1, B16F10-H658）评估免疫激活和抗肿瘤效果。

**4. 研究结果**

**4.1 cDC1特征评分的预后价值及HCC和黑色素瘤肿瘤微环境的单细胞图谱**

基于TCGA-LIHC和TCGA-SKCM队列的 bulk RNA-seq 数据，研究人员计算了每个肿瘤样本的cDC1特征评分（基于CLEC9A, XCR1, CLNK, THBD, CADM1五个核心基因的表达）。根据队列中位数将患者分为高低两组，发现高cDC1评分在两个队列中均与更长的总生存期相关（LIHC, log-rank P = 0.01; SKCM, P = 4.9 × 10^-4）。对GEO数据库来源的scRNA-seq数据进行整合分析显示，肿瘤与正常样本间cDC1比例无显著差异，且cDC1的抗原提呈和成熟模块评分亦无显著差异。细胞通讯分析揭示，肿瘤中免疫活化通路显著减少：HCC中XCL1-XCR1信号显著降低，而黑色素瘤中CD40-CD40L信号降低，表明不同肿瘤类型破坏DC-T细胞共刺激的不同环节。同时，XCR1在cDC1上选择性高表达（HCC中58.5%，黑色素瘤中48.3%的cDC1为XCR1⁺），支持XCL1作为cDC1靶向结构域。

**4.2 双功能mXCL1-mCD40L mRNA佐剂的设计与体外表征**

研究人员构建了编码mXCL1-mCD40L融合蛋白（由(G4S)3连接子连接）的mRNA，并包装成LNP。体外实验显示，mXCL1-mCD40L mRNA-LNP处理RAW264.7细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs）后，显著上调了Nos2、Il1b、Il12b、Il6、Tnf等促炎细胞因子，以及Cxcl10、Ccl2等趋化因子的表达，同时激活NF-κB通路相关基因（Nfkb1, Nfkb2）。在BMDCs中，DC成熟标志物Cd86表达显著升高。

**4.3 mXCL1-mCD40L融合mRNA-LNP的结构完整性与功能验证**

AlphaFold 3结构预测显示，融合蛋白中mXCL1和mCD40L各自保持典型的趋化因子折叠构象和TNF超家族结构域，且( G4S)3柔性连接子避免了空间位阻。ELISA证实融合蛋白被有效分泌至细胞外。Transwell实验证实XCL1结构域保留了趋化活性，可促进BMDC迁移。流式细胞术和qPCR证实CD40L结构域保留了诱导DC成熟的功能，且呈剂量依赖性。

**4.4 mXCL1-mCD40L mRNA-LNP增强GPC3疫苗在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效**

在B16F10-hGPC3皮下荷瘤模型中，GPC3+mXCL1-mCD40L组展现最强的肿瘤生长抑制（生长速率13.72 ± 3.94 mm3/天），显著优于GPC3+Luc组（34.91 ± 4.09 mm3/天, P = 3.8 × 10^-4）和GPC3+mCD40L单佐剂组（29.78 ± 4.07 mm3/天, P = 0.0046）。Kaplan-Meier生存分析显示所有GPC3治疗组均显著延长荷瘤鼠生存期。值得注意的是，mXCL1单佐剂组未改善疗效。在HPV相关抗原（H658，编码HPV16/18/52的E6/E7）模型中，H658+mXCL1-mCD40L联合治疗在TC-1和B16F10-H658荷瘤模型中均较单疫苗组显著抑制肿瘤生长。

**4.5 融合mRNA-LNP相较单独佐剂mRNA联合给药的优势**

在B16F10-hGPC3模型中，直接比较了融合设计与联合递送的效果。在匹配总mRNA剂量下，GPC3+mXCL1-mCD40L融合组的肿瘤生长速率显著低于GPC3+mXCL1+mCD40L共递送组（P = 0.0018），而共递送组与GPC3单疫苗组无显著差异（P = 0.92）。IFN-γ ELISPOT结果显示，融合方案诱导的GPC3特异性IFN-γ分泌T细胞（879 ± 37 SFC/10⁶）显著高于GPC3单疫苗组（465 ± 125, P < 0.001）和共递送组（568 ± 128, P = 0.003）。

**4.6 mXCL1-mCD40L mRNA-LNP促进抗原获取与提呈**

利用B16F10-GFP模型追踪抗原摄取，发现mXCL1-mCD40L融合mRNA组中，引流淋巴结（draining lymph nodes, dLNs）内CD11c⁺CD103⁺ cDC1群体中GFP⁺细胞比例显著高于Luc对照组（P < 0.001）和共递送组（P < 0.01）。在B16-OVA模型中，检测CD11c⁺CD103⁺SIINFEKL–H-2Kb⁺抗原特异性DC，融合佐剂组在dLNs和肿瘤组织中均展现出最高比例的抗原特异性DC，显著高于OVA单疫苗组和共递送组。

**4.7 肌内注射mXCL1-mCD40L mRNA-LNP的局部生物分布与增强的抗肿瘤疗效**

生物发光成像和细胞水平分布分析显示，肌内注射的mRNA-LNP其蛋白表达几乎局限于注射部位肌肉。在区域DC成熟评估中，mXCL1-mCD40L mRNA-LNP在注射同侧dLNs中显著提高了成熟DC（CD11c⁺MHC-II⁺CD86⁺）比例（约50%），而对侧dLNs无显著影响。在B16F10-H658模型中，对比给药途径发现，肌内注射的H658+mXCL1-mCD40L组合显著抑制肿瘤生长（P < 0.0001），而瘤内注射的各组均未观察到显著抑瘤效果。安全性评估显示，GPC3+mXCL1-mCD40L联合方案未引起急性肝毒性或系统性IL-12反应，且增加了外周血CD8⁺ T细胞比例。

**5. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，该研究基于临床转录组学证据，揭示了不同实体瘤（HCC和黑色素瘤）在cDC1募集（XCL1-XCR1）或成熟（CD40-CD40L）信号上的差异化缺陷，并据此设计了融合型双功能佐剂。体内数据证实，单纯趋化信号（mXCL1）不足以改善疗效，而融合佐剂通过同时提供募集和成熟信号实现了更强的肿瘤控制，这印证了两种信号耦联的必要性。与共递送两种独立mRNA相比，单分子融合设计可减少时空错配，简化制剂开发和质量控制。安全性评估和冻干制剂可行性初步支持其临床转化潜力。研究局限性包括：结果主要在免疫活性小鼠肿瘤模型中产生，需进一步验证其与人类免疫生物学的相关性；B16F10-hGPC3为工程化模型，异种人GPC3可能存在额外免疫原性；实验中使用了剂量匹配的Luc mRNA-LNP作为对照，但未包含基线PBS和空LNP对照组。结论部分总结，研究人员开发了一种高效且耐受性良好的双功能mRNA佐剂平台，不仅为克服mRNA肿瘤疫苗在实体瘤中的疗效瓶颈提供了创新策略，也为靶向cDC1功能恢复的癌症免疫疗法建立了可行的设计框架。