《The Veterinary Journal》：Comparative evaluation of real-time PCR and droplet digital PCR targeting the
B646L (p72) and
CP204L (p30) genes for early detection of African swine fever virus
编辑推荐：
•首次系统比较了来自两个平台、针对不同靶基因的四种非洲猪瘟病毒PCR检测方法•针对B646L基因的ddPCR在ASFV检测中表现出最高的灵敏度•针对CP204L基因的qPCR改善了感染后3天的早期检测•检测性能取决于平台与靶基因两方面引言非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（A
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首次系统比较了来自两个平台、针对不同靶基因的四种非洲猪瘟病毒PCR检测方法
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针对B646L基因的ddPCR在ASFV检测中表现出最高的灵敏度
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针对CP204L基因的qPCR改善了感染后3天的早期检测
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检测性能取决于平台与靶基因两方面
引言
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种传染性极强、致死性极高的家猪和野猪出血性疾病。该病以高热、多系统出血、严重免疫抑制为特征，感染高毒力毒株后死亡率可接近100%（Sánchez-Vizcaíno et al., 2015, Schulz et al., 2017）。自2007年在高加索地区暴发以来，ASF已广泛传播至欧洲、亚洲，最近又蔓延至加勒比地区，给全球养猪业造成了巨大的经济损失（Zhou et al., 2018, Sun et al., 2021）。在越南，2019年首次报告了ASF疫情，随后迅速在全国范围内扩散，造成严重的经济损失，并对猪肉生产和粮食安全产生重大影响。尽管ASFV疫苗研发已取得一定进展，但疾病防控仍主要依赖生物安全措施、流行病学监测以及对感染动物的早期识别，以防止病毒传播（Pikalo et al., 2021, WOAH, 2024）。
在缺乏有效抗病毒治疗手段、且现有疫苗对遗传多样的田间毒株保护效力不稳定的情况下，快速准确的诊断仍是ASF防控策略的基石。在现有诊断方法中，实时聚合酶链式反应（qPCR）是世界动物卫生组织（WOAH）推荐的ASFV实验室诊断参考分子检测方法（WOAH, 2024）。大多数经验证的qPCR检测方法针对编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因，因为该基因在不同ASFV分离株间具有很高的序列保守性和遗传稳定性（Fernández-Pinero et al., 2013, Pikalo et al., 2022）。然而，在样本病毒DNA浓度较低或感染极早期病毒基因组拷贝数尚少时，qPCR的分析灵敏度可能会下降（Yang and Rothman, 2004, Pikalo et al., 2022）。
改进ASFV早期检测的一种替代策略是选择更为合适的基因组靶点。除B646L外，编码结构蛋白p30的CP204L基因作为早期分子诊断的潜在靶点也日益受到关注。p30蛋白是ASFV复制周期中最早表达的病毒蛋白之一，在病毒吸附并内化进入宿主细胞过程中发挥关键作用。最近的研究证据表明，CP204L可在感染早期阶段即被检测到，这凸显了其在临床显症出现前识别ASFV的潜力（Weng et al., 2025）。此前的研究也表明，p30具有高度免疫原性，并已被广泛用作酶联免疫吸附试验（ELISA）中检测ASFV抗体的靶抗原（Barderas et al., 2001, Cubillos et al., 2013, Oviedo et al., 1997）。此外，Tram等人（2024）报道，针对CP204L的qPCR检测方法比针对若干常规基因组标记的检测方法更早检出ASFV。
除靶基因选择外，核酸扩增平台的进步也有望进一步提升ASFV检测能力。近年来，液滴数字PCR（ddPCR）作为一种强大的分子诊断工具崭露头角，因为它无需外部标准曲线即可实现核酸的绝对定量。该技术将每个反应分成数千个纳升级液滴，基于泊松统计实现目标分子的精确定量（Quan et al., 2018, The dMIQE Group et al., 2020）。与qPCR相比，ddPCR通常具有更高的分析灵敏度、对PCR抑制剂的耐受性更强，且在目标DNA浓度较低的样本中表现更优（Lu et al., 2020, Mao et al., 2019）。在ASFV检测方面，已有数项研究证明ddPCR能增强低拷贝样本中病毒DNA的检出，并降低qPCR产生假阴性结果的可能性（Wu et al., 2018, Yang et al., 2024）。然而，尽管qPCR与ddPCR在ASFV诊断中的应用日益广泛，但目前仍缺乏关于针对B646L（p72）和CP204L（p30）基因的ddPCR检测方法是否能够提供与qPCR相当或更优诊断性能的证据，特别是在感染早期及病毒DNA载量较低的样本中。
尽管多重及多靶标ASFV检测方法日益增多，但采用单靶标检测方法可在一定程度上为区分扩增平台效应与靶基因效应提供受控框架。已有研究报道了p30用于ASFV早期检测的潜力以及ddPCR更高的分析灵敏度，但在可比的实验条件下，针对不同ASFV靶点跨qPCR和ddPCR平台进行直接比较的研究仍较为有限。因此，本研究旨在开发并评估针对ASFV的B646L（p72）和CP204L（p30）基因的qPCR与ddPCR检测方法。具体而言，本研究利用实验感染猪采集的血样和组织样本，比较了四种检测方法的分析性能、诊断准确性及早期检测能力。研究结果提供了有关靶基因与扩增平台对ASFV检测性能贡献的比较证据，并为进一步评估用于ASFV监测与早期检测的分子检测方法提供支持。
章节摘录
质粒标准品
两种含有非洲猪瘟病毒（ASFV）B646L基因片段（编码主要衣壳蛋白p72）和CP204L基因片段（编码p30蛋白）的质粒标准品由富沙生物技术有限公司（越南芹苴）合成，并分别克隆至pUC19载体中。B646L质粒（以下简称p72质粒）和CP204L质粒（以下简称p30质粒）用作相应qPCR和
qPCR与ddPCR检测方法的分析性能
两种qPCR检测方法在所测试的稀释范围内均显示出循环阈值（Ct）值与相应质粒标准品浓度之间优异的线性关系（图1）。针对B646L（p72）的qPCR检测方法得到的标准曲线斜率为-3.216，决定系数（R2）为0.994，扩增效率为104.63%。相比之下，针对CP204L（p30）的qPCR检测方法所得斜率为-3.567，扩增效率为90.38%，
讨论
非洲猪瘟（ASF）仍是影响全球养猪业最为毁灭性的传染性疾病之一。在缺乏有效抗病毒治疗手段、疾病防控在很大程度上依赖于早期检测和快速清除感染动物的情况下，高灵敏度且可靠的分子诊断方法至关重要。世界动物卫生组织（WOAH）已推荐多种针对ASFV基因组的实时PCR（qPCR）检测方法用于常规ASF
结论
本研究证明，ASFV分子检测方法的诊断性能取决于扩增平台与基因组靶点两方面。在所评估的四种检测方法中，p72-ddPCR在ASFV检测中显示出最高的整体诊断性能，特别是在病毒DNA浓度较低的样本及感染早期阶段，而p30-qPCR则在提高病毒血症早期检测方面表现出潜力。然而，ddPCR的性能
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南进行。本研究已获得越南农林大学动物研究使用动物伦理委员会（AEC-NLU）批准。（批准编号：NLU250702）
CRediT作者贡献声明
Duy Ba Ngo：撰写——审阅与编辑。Tran Linh Ngoc My：形式分析、数据整理。Nguyen Suong Le Thu Hong：撰写——初稿，可视化，形式分析，数据整理。Luan Minh Nguyen：撰写——初稿，可视化，形式分析，数据整理。Tram Thi Ngoc Ngo：撰写——初稿，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据整理，概念构思。Duy Tien Do：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本论文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢越南胡志明市农林大学和越南联合科学公司提供检测设施。
Tram Thi Ngoc Ngo|Luan Minh Nguyen|Suong Hong Thu Le Nguyen|Linh Tran Ngoc My|Duy Ba Ngo|Anh Thi Ngoc Dang|Nam Van Hai Tran|Minh Thi Trinh|Duy Tien Do
