HDAC1通过H3K27ac重塑抑制NRF2转录并加重新霉素诱导的耳蜗毛细胞损伤

《Neurochemical Research》：HDAC1 Represses NRF2 Transcription via H3K27ac Remodeling to Aggravate Neomycin-Induced Cochlear Hair Cell Damage

　　

氨基糖苷类药物诱导的听力损失与耳蜗毛细胞的氧化应激和线粒体功能障碍密切相关，但其上游表观遗传机制尚不完全清楚。本研究探讨了组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）是否通过转录抑制NRF2参与新霉素诱导的耳蜗损伤。在HEI-OC1细胞中，新霉素增加了细胞凋亡、活性氧（ROS）积累、线粒体去极化和线粒体超氧化物产生，同时伴随HDAC1上调和NRF2抑制。HDAC1沉默可减轻这些改变并恢复NRF2表达。染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）显示，新霉素暴露后HDAC1在NRF2近端启动子上的占有率增加，而H3K27ac富集减少；HDAC1敲低则逆转了这些变化。一致地，HDAC1沉默增加了NRF2启动子活性，而HDAC1过表达进一步抑制NRF2转录并降低H3K27ac水平。HDAC1敲低还恢复了核内NRF2丰度，并增加了下游抗氧化蛋白HO-1和NQO1的表达。重要的是，NRF2过表达部分挽救了HDAC1过表达引起的细胞活力和ATP含量下降，支持NRF2在HDAC1下游发挥功能作用。在体内实验中，丙戊酸（VPA）部分保留了听觉阈值，减少了耳蜗毛细胞凋亡，恢复了NRF2表达，并改善了新霉素处理小鼠的线粒体超微结构损伤。综上所述，这些发现确定了HDAC1相关的NRF2启动子H3K27ac重塑是新霉素诱导耳蜗毛细胞损伤的一个表观遗传机制，并支持HDAC1–NRF2调控作为耳保护治疗的潜在靶点。

一、研究背景与科学问题

获得性感觉神经性听力损失（SNHL）是全球重大健康负担，可由噪声暴露、耳毒性药物（包括氨基糖苷类和铂类化疗药物）、衰老及代谢紊乱等因素诱发。大量证据支持线粒体功能障碍是关键的病理驱动因素，导致活性氧（ROS）过度产生，进而引起毛细胞凋亡和耳蜗损伤。因此，阐明协调线粒体质控、抗氧化防御和促生存信号的调控程序，对于开发保护听觉功能的有效干预措施至关重要。

表观遗传调控（包括组蛋白修饰和染色质重塑）已被确定为感觉毛细胞发育、存活和损伤应答的重要决定因素。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态，塑造涉及细胞周期调控、分化、程序性细胞死亡和应激适应的转录程序。HDAC1是I类锌依赖性组蛋白去乙酰化酶，参与转录抑制和应激响应性染色质调控。尽管HDAC1活性改变已被提示与耳蜗毛细胞损伤和听力损失有关，但其在氨基糖苷类药物诱导的耳蜗损伤中的具体作用尚不清楚。

转录因子NRF2是抗氧化防御和细胞氧化还原稳态的核心调控因子。NRF2及其下游抗氧化效应因子（包括HO-1和NQO1）的激活可限制ROS积累并促进耳蜗毛细胞在耳毒性应激下的存活。NRF2激活可保护耳蜗毛细胞免受新霉素诱导的损伤，而NRF2信号受损则增加对氧化损伤的易感性。然而，HDAC1是否在耳毒性损伤期间直接限制NRF2转录活性尚待阐明。

基于此，本研究探讨了HDAC1是否通过H3K27ac重塑结合NRF2启动子并抑制其转录，以及NRF2恢复能否对抗HDAC1相关的氧化和生物能量功能障碍，并通过体内实验评估药理学HDAC抑制对耳蜗损伤的保护作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员发现，新霉素处理显著增加了HEI-OC1细胞的凋亡、ROS积累、线粒体去极化和线粒体超氧化物产生，同时伴随HDAC1上调和NRF2抑制。HDAC1沉默可减轻这些改变并恢复NRF2表达。ChIP-qPCR证明新霉素暴露后HDAC1在NRF2近端启动子上的占有率增加，而H3K27ac富集减少；HDAC1敲低逆转了这些变化。HDAC1沉默增加NRF2启动子活性，而HDAC1过表达进一步抑制NRF2转录并降低H3K27ac水平。HDAC1敲低恢复了核内NRF2丰度并增加下游抗氧化蛋白HO-1和NQO1。NRF2过表达部分挽救了HDAC1过表达引起的细胞活力和ATP含量下降。体内实验中，丙戊酸（VPA）部分保留了听觉阈值，减少耳蜗毛细胞凋亡，恢复NRF2表达并改善线粒体超微结构损伤。这些发现确定了HDAC1相关的NRF2启动子H3K27ac重塑是新霉素诱导耳蜗毛细胞损伤的表观遗传机制，支持HDAC1–NRF2调控作为耳保护的潜在靶点。

三、主要技术方法

本研究采用多种关键技术方法。体外实验使用HEI-OC1细胞系（来源于House Ear Institute），以1 mM新霉素处理24小时建立耳毒性损伤模型。基因操作采用siRNA介导的HDAC1敲低和质粒介导的HDAC1/NRF2过表达。表观遗传分析采用染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测HDAC1和H3K27ac在NRF2启动子区域的富集，双荧光素酶报告基因实验评估NRF2启动子活性。细胞功能检测包括TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术评估凋亡、JC-1染色检测线粒体膜电位、DCFH-DA检测细胞内ROS、MitoTracker检测线粒体完整性、MitoSOX检测线粒体超氧化物。蛋白表达通过Western blotting分析，mRNA水平通过RT-qPCR检测。体内实验使用4周龄雄性C57BL/6J小鼠（购自昆明医科大学实验动物中心），新霉素（200 mg/kg）皮下注射连续5天建立听力损失模型，VPA（200 mg/kg）在新霉素注射前2小时腹腔注射。听觉功能通过听性脑干反应（ABR）评估，耳蜗毛细胞凋亡通过免疫荧光染色检测，线粒体超微结构通过透射电子显微镜观察。

四、研究结果

1. 1.
   新霉素诱导HEI-OC1细胞凋亡、氧化应激、线粒体功能障碍和HDAC1上调

通过TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术证实新霉素处理显著增加细胞凋亡。JC-1染色显示线粒体膜电位丧失，DCFH-DA染色显示细胞内ROS积累增加，MitoTracker染色显示线粒体完整性受损，MitoSOX染色显示线粒体超氧化物产生增加。Western blotting显示HDAC1蛋白表达显著增加。

1. 2.
   HDAC1沉默减轻新霉素诱导的凋亡和线粒体功能障碍

Western blotting确认si-HDAC1转染有效敲低HDAC1。HDAC1沉默显著减少TUNEL阳性细胞比例和凋亡指数，部分恢复线粒体膜电位，减少细胞内ROS积累，增加MitoTracker荧光（改善线粒体完整性），降低线粒体超氧化物产生。

1. 3.
   HDAC1在NRF2启动子上的占有率与H3K27ac减少和转录抑制相关

Western blotting显示新霉素增加HDAC1表达并显著降低NRF2蛋白水平，HDAC1沉默部分恢复NRF2蛋白。RT-qPCR证实新霉素降低NRF2 mRNA表达，HDAC1敲低部分恢复。ChIP-qPCR显示新霉素显著增加HDAC1在NRF2近端启动子（-62至+20 bp）的富集，HDAC1沉默显著降低启动子占有率；相反，H3K27ac富集在新霉素暴露后显著减少，HDAC1沉默后恢复至基础水平。正常IgG和远端基因组区域仅显示低背景富集。

1. 4.
   HDAC1负向调控NRF2启动子活性

双荧光素酶报告基因实验显示HDAC1沉默显著增加NRF2启动子活性并部分恢复新霉素诱导的启动子活性降低；HDAC1过表达显著抑制NRF2启动子活性并在新霉素暴露后进一步降低。RT-qPCR证实HDAC1过表达降低NRF2 mRNA表达。Western blotting确认HDAC1过表达成功并伴随NRF2蛋白和H3K27ac水平降低。

1. 5.
   NRF2恢复抵消HDAC1介导的抗氧化信号和细胞生物能量损伤

核质分离验证显示Lamin B1主要在核组分、GAPDH主要在胞质组分。Western blotting确认HDAC1过表达降低NRF2表达，NRF2过表达显著恢复NRF2水平（包括在持续HDAC1过表达条件下）。新霉素显著降低核内NRF2丰度，HDAC1敲低显著恢复核内NRF2水平。HO-1和NQO1在新霉素处理后显著降低，HDAC1敲低后部分恢复。CCK-8实验显示新霉素降低细胞活力，HDAC1过表达加重此降低，NRF2过表达显著改善细胞活力并部分挽救HDAC1过表达引起的活力丧失。ATP检测显示相似模式：新霉素降低ATP含量，HDAC1过表达进一步降低，NRF2过表达恢复ATP水平并显著减轻HDAC1过表达诱导的ATP耗竭。

1. 6.
   丙戊酸在体内减轻新霉素诱导的听力损失和耳蜗损伤

ABR检测显示新霉素暴露显著升高各测试频率的听觉阈值，VPA处理显著降低ABR阈值（与Neo+DMSO组相比），表明部分保留听觉功能。免疫荧光显示新霉素暴露后TUNEL/Myosin7a双阳性毛细胞显著增加，VPA显著降低TUNEL阳性毛细胞比例。Western blotting显示新霉素增加耳蜗HDAC1表达并降低NRF2蛋白水平，VPA处理部分逆转这两种改变。透射电子显微镜显示新霉素处理耳蜗出现线粒体肿胀、嵴破坏和结构恶化，VPA处理更好地保留了线粒体膜和嵴。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究将HDAC1依赖的NRF2抑制确定为新霉素诱导耳蜗毛细胞损伤的表观遗传组分。新霉素增加HDAC1表达和启动子占有率，伴随H3K27ac富集减少、NRF2转录降低和启动子活性受损；HDAC1沉默恢复NRF2表达并减轻氧化和线粒体损伤；HDAC1过表达进一步抑制NRF2转录。NRF2恢复部分挽救了HDAC1过表达引起的细胞活力和ATP产生下降，支持NRF2作为HDAC1相关细胞损伤的下游介质。研究支持启动子相关H3K27ac重塑是HDAC1与NRF2抑制之间的机制联系。

NRF2在耳蜗毛细胞中限制氧化损伤并促进对耳毒性应激的抵抗，同时支持线粒体能量代谢和氧化还原稳态。本研究中NRF2过表达部分挽救了HDAC1过表达引起的细胞活力和ATP含量下降，将NRF2的功能角色从关联性抗氧化标志物扩展为HDAC1介导的氧化和生物能量损伤的功能性参与者。

体内VPA实验应被解释为HDAC抑制保护潜力的证据，而非HDAC1特异性因果关系的药理学证明，因为VPA抑制多种HDAC亚型并具有HDAC非依赖性药理作用。讨论还指出HDAC1可能调控非组蛋白，包括NRF2乙酰化状态影响其DNA结合能力、转录活性和核质分布，但本研究未直接检测该可能性，数据具体支持HDAC1相关的NRF2启动子染色质机制而非直接NRF2去乙酰化。

研究局限性包括：VPA是广谱HDAC抑制剂且具有多效性药理作用，动物数据不能确立HDAC1特异性药理学因果性；未检测HDAC1对NRF2乙酰化的直接调控；研究聚焦急性损伤，未解决H3K27ac丢失与NRF2抑制之间的时间顺序，也未评估长期听觉恢复和耳蜗突触完整性；机制实验主要在HEI-OC1细胞中进行，需要在原代耳蜗外植体和条件性Hdac1遗传模型中验证细胞类型特异性和体内因果性。

结论部分翻译：本研究确定了HDAC1相关的NRF2转录抑制（通过降低NRF2启动子H3K27ac富集）是新霉素诱导耳蜗毛细胞损伤的重要机制。HDAC1沉默在体外恢复NRF2信号并减轻氧化和线粒体损伤，而VPA的药理学HDAC抑制在体内部分保留听觉功能和耳蜗完整性。这些发现突出HDAC1–NRF2调控作为耳保护的潜在表观遗传靶点，同时有必要使用HDAC1选择性方法进行进一步研究。