《Translational Oncology》：Single-cell and spatial transcriptomics reveal a DLL4-associated tip-like endothelial niche linked to neoadjuvant chemotherapy non-response in muscle-invasive bladder cancer
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摘要：膀胱癌仍是一项重大的全球健康负担，2022年全球估计有614,298例新发病例和220,596例死亡。在其临床病理实体中，肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）代表一种侵袭性疾病状态，其特征是复发、转
摘要：膀胱癌仍是一项重大的全球健康负担，2022年全球估计有614,298例新发病例和220,596例死亡。在其临床病理实体中，肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）代表一种侵袭性疾病状态，其特征是复发、转移进展和癌症特异性死亡的风险显著升高。对于顺铂适用患者，基于顺铂的新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）后行根治性膀胱切除术仍是标准治疗策略。然而，NAC的获益存在显著异质性。尽管部分患者可实现病理学完全缓解或有意义的分期降级，但许多患者在治疗后仍残留肌层浸润性和/或淋巴结阳性疾病。因此，阐明对基于顺铂的NAC无应答的生物学基础仍是MIBC中一项重要的未满足需求。既往针对MIBC中基于顺铂的NAC应答的研究主要集中于肿瘤内在决定因素，包括DNA损伤修复的改变、基因组不稳定性和转录组定义的分子亚型。尽管这些研究推进了当前对顺铂敏感性的理解，但能够可靠识别最可能从NAC中获益患者的临床稳健生物标志物仍然缺乏。同时，越来越多的证据表明，治疗应答不仅受恶性细胞内在程序的影响，还受到更广泛的肿瘤微环境的塑造。共识分子分类已显示，MIBC亚型在免疫和基质浸润方面存在显著差异，包括一个具有明显平滑肌、内皮和成纤维细胞信号的基质富集亚型。与此同时，对NAC治疗肿瘤的分析表明，残留耐药病灶可能经历独特的生物学重塑，而治疗前免疫微环境与病理学应答和临床结局相关。在这一更广泛的微环境背景下，肿瘤血管系统尤为值得关注。肿瘤血管不仅仅是营养和药物输送的被动管道；相反，它们积极影响灌注、缺氧、间质压力和治疗可及性，从而塑造治疗应答。内皮细胞也直接参与血管生成、血管通透性、免疫细胞运输和基质通讯。最近的单细胞研究进一步揭示了肿瘤相关内皮细胞的显著异质性，包括血管生成性、尖端样、茎秆样和组织重塑的内皮状态。这些观察结果表明，内皮状态异质性可能代表了治疗耐药的一个重要细胞背景。然而，在MIBC中，内皮异质性是否形成一个与基于顺铂的NAC无应答相关的空间组织化微环境尚不清楚。在调控内皮状态规范和血管重塑的通路中，Notch信号尤其相关，因为它介导相邻细胞间的接触依赖性通讯，并对血管生成、肿瘤免疫和治疗耐药产生情境依赖性效应。DLL4是一种在血管生成性内皮中富集的经典Notch配体，是内皮状态模式和血管重塑的关键调节因子。除了内皮内在调控外，Notch信号还参与内皮-血管周围串扰；最近的血管模型研究表明，NOTCH1和NOTCH3在周细胞诱导的血管稳定中协同作用，其中DLL4在此过程中充当重要配体。在膀胱癌中，通路导向分析进一步将包括DLL4和NOTCH3在内的Notch组分视为疾病生物学的潜在相关分子特征。综上所述，这些发现提出了一个可能性，即DLL4-NOTCH3相关内皮程序可能促成了MIBC中一个与治疗相关的微环境。解决这一问题的主要障碍在于方法学层面。批量转录组分析平均了混合细胞群体中的信号，并提供关于肿瘤组织内耐药程序空间组织的有限信息。相比之下，单细胞RNA测序可以解析罕见的细胞状态和谱系限制性转录程序，而空间图谱分析方法则保留了组织结构，并能够在肿瘤微环境中绘制区室化信号传导和细胞-细胞邻近关系。在膀胱癌中，单细胞研究已经强调了显著的上皮、基质和免疫异质性，包括特化的成纤维细胞程序以及与干性和上皮-间充质转化相关的细胞状态。最近，整合的单细胞和空间图谱分析已在复发性和肌层浸润性膀胱肿瘤中展示了显著的瘤内异质性和空间结构化的微环境组织。这些进展为通过整合的单细胞和空间转录组学框架研究MIBC中的NAC无应答提供了强有力的理论依据。在本研究中，研究人员整合了膀胱癌单细胞转录组、空间转录组和批量转录组数据集，以研究与基于顺铂化疗无应答相关的多细胞结构。研究人员特别探究了内皮异质性是否与一个与治疗耐药相关的空间组织化微环境有关。研究人员的分析提名了一个以尖端样内皮状态为中心的DLL4-NOTCH3相关内皮程序，作为理解MIBC中NAC无应答的候选框架。
研究背景与科学问题
膀胱癌是全球重大健康负担，2022年新发病例约61.4万例，死亡约22.1万例。其中，肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）是一种侵袭性强、复发和转移风险高的疾病。对于顺铂适用患者，基于顺铂的新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）后行根治性膀胱切除术是标准治疗方案。然而，NAC疗效存在显著异质性：部分患者可获得病理完全缓解，但多数患者治疗后仍残留肌层浸润性或淋巴结阳性病变。既往研究主要聚焦于肿瘤内在因素，如DNA损伤修复、基因组不稳定性和分子亚型，但仍缺乏可靠的预测性生物标志物。越来越多的证据表明，治疗应答不仅由恶性细胞内在程序决定，还受肿瘤微环境影响，特别是肿瘤血管系统——它不仅是营养和药物的被动通道，还能主动影响灌注、缺氧、间质压力和治疗药物递送。内皮细胞本身也存在显著异质性，包括血管生成性、尖端样、茎秆样等不同状态。然而，在MIBC中，这种内皮异质性是否形成与NAC无应答相关的空间组织化微环境，尚不明确。为此，研究人员整合了单细胞转录组、空间转录组和批量转录组数据，系统探究了与NAC无应答相关的多细胞结构。
主要关键技术方法
研究人员首先利用公开的单细胞RNA测序数据集GSE326225（含8例膀胱癌肿瘤样本）构建肿瘤微环境图谱；采用Seurat进行质量控制、Harmony批次校正和UMAP聚类注释。利用批量转录组数据集GSE169455（Affymetrix平台）定义化疗应答相关基因程序，并通过limma进行差异表达分析。通过AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore五种方法将非应答相关程序投射至单细胞图谱。对内皮细胞进行亚聚类分析，鉴定出TipEC_2亚群。运用scTour进行内皮伪时间轨迹推断，LIANA和CellPhoneDB进行细胞-细胞通讯分析。空间转录组分析基于10x Genomics Visium数据（GSE319536），采用RCTD进行细胞类型去卷积，MISTy评估多尺度空间邻域网络。利用DoRothEA和VIPER推断转录因子活性，CellOracle模拟RBPJ扰动。预后模型在TCGA-BLCA（404例）训练，GSE13507（165例）外部验证，采用Lasso+CoxBoost算法构建。体外实验使用T24和T24/DDP细胞系，通过CCK-8法和RT-qPCR验证NOTCH3相关信号在顺铂耐药中的作用。
研究结果
1. 膀胱癌单细胞图谱揭示化疗无应答转录特征
通过整合8例肿瘤样本的单细胞转录组，经质量控制和无监督聚类，共鉴定出10个主要细胞谱系，包括上皮细胞、免疫细胞、基质细胞和血管细胞。差异表达分析显示，非应答者（non-responders, NR）肿瘤中HOXD10、SPP1、FN1、MAP1B、HBB和DLL4等基因上调，而CXCL9、CD24和AKR1B1下调。功能富集分析提示NR相关基因涉及细胞-细胞黏附、同嗜性细胞黏附和骨骼系统形态发生等过程。通过五种评分方法的综合得分评估，内皮细胞显示出最高的NR程序得分，提示血管系统可能与化疗无应答密切相关。
2. 内皮亚聚类鉴定出与化疗无应答相关的尖端样内皮亚群TipEC_2
对内皮细胞重新聚类，获得8个转录不同的亚群，包括ArtEC、CapEC、CapEC_2、VenEC、VenEC_Tip、ProlEC、TipEC_1和TipEC_2。复合评分显示，NR相关程序优先富集于尖端样内皮状态，尤其是TipEC_2。功能富集分析表明，TipEC_2富含内皮发育、细胞-底物黏附、上皮细胞迁移、局灶黏附、ECM-受体相互作用和Notch信号通路，而TipEC_1和VenEC_Tip主要与氧化磷酸化和核糖体生物合成相关。在GSE169455的共识分子亚型中，TipEC_2评分较高的亚型往往表现出更高的NAC无应答比例（Pearson r=0.78）。生存分析显示，高TipEC_2评分的患者总生存期较差，Cox回归确认TipEC_2为显著风险相关内皮特征。
3. 转录和空间表征揭示TipEC_2位于上皮-血管周围微环境中
scTour伪时间分析显示TipEC_2处于内皮转录连续体的中间位置。细胞-细胞通讯分析预测TipEC_2与上皮细胞和周细胞之间存在多个配体-受体关联，其中DLL4-NOTCH3是突出的推断配体-受体对。空间转录组分析证实，DLL4表达区域与NOTCH3富集区域空间相邻，TipEC_2特征富集的斑点优先分布于上皮评分高的区域附近。多尺度邻域网络分析（MISTy）一致地将TipEC_2置于包含上皮细胞和周细胞的群落中，并在独立的空间切片中得到重复验证。
4. 整合优先排序确定DLL4为TipEC_2相关且与化疗无应答相关的配体
通过交集TipEC_2特异性标志物、批量NR基因集和TipEC_2来源配体，DLL4成为唯一共享的候选分子。DLL4优先富集于尖端样内皮状态，尤其在TipEC_2中。在GSE169455中，DLL4具有中等区分非应答者的能力；在TCGA-BLCA中，高DLL4表达与较差总生存期相关。计算机模拟DLL4敲除扰动分析提示其可能影响白细胞黏附、迁移、T细胞活化和MHC II类抗原呈递等免疫相关过程。
5. 计算建模将DLL4阳性TipEC_2状态与NOTCH3导向信号和RBPJ相关内皮状态转变联系起来
DLL4阳性细胞表现出较高的推断传入和传出通讯得分。配体-受体分析鉴定了DLL4阳性群体与上皮或周细胞之间的JAG1-NOTCH3、JAG2-NOTCH3和DLL4-NOTCH3等NOTCH3相关互作。转录因子活性分析显示，DLL4阳性TipEC_2细胞中RBPJ活性增加。CellOracle分析在TipEC_2细胞中进行RBPJ扰动模拟，结果显示RBPJ敲除产生了非随机扰动模式并改变了预测的发育流。
6. 预后评估与探索性药物靶点富集分析
基于DLL4阳性TipEC_2相关基因程序，在TCGA-BLCA中构建了总生存期风险模型，并在TCGA内部验证队列和GSE13507外部验证队列中评估。Lasso+CoxBoost策略最终保留了13个基因构成预后签名。高风险评分患者的总生存期显著较差。时间依赖ROC分析显示了模型的区分性能。Cox回归确认风险评分为独立预后因素。列线图和决策曲线分析评估了临床净获益。探索性Drug2Cell分析揭示了DLL4阳性和阴性TipEC_2细胞之间药物靶点基因集得分的差异。
7. NOTCH3相关转录特征在顺铂耐药T24/DDP细胞中升高
CCK-8实验证实T24/DDP细胞对顺铂的敏感性显著低于亲代T24细胞（IC50分别为2.461 μg/mL和0.623 μg/mL，耐药指数3.95）。RT-qPCR显示T24/DDP细胞中NOTCH3、HES1和HEY1的mRNA表达显著升高，而RBPJ无明显变化。DAPT（γ-分泌酶抑制剂）处理降低了HES1和HEY1表达，并将顺铂IC50从2.40 μg/mL降至1.41 μg/mL，表明抑制Notch信号可增加顺铂敏感性。
讨论与结论
本研究支持一个以微环境为中心的观点，即MIBC中对基于顺铂的NAC无应答并非单纯由恶性细胞内在程序驱动，而是嵌入在一个空间组织化的血管微环境中。通过整合单细胞、空间和批量转录组数据，研究人员鉴定出TipEC_2作为一个与治疗相关的尖端样内皮状态，并提出DLL4-NOTCH3-RBPJ相关信号程序作为该微环境的候选组织特征。T24/DDP实验进一步支持NOTCH3相关信号与顺铂耐药的关联。这些发现将膀胱癌化疗耐药的理解从主要集中于肿瘤内在机制拓展至多细胞和空间组织的框架。研究人员指出，未来研究需在内皮-肿瘤互作模型中对该内皮微环境进行功能验证，并评估其能否转化为改进的风险分层和机制指导的治疗策略。研究局限性包括：单细胞样本数量有限、NAC无应答定义依赖于术后病理替代标准、非应答信号先由批量水平推导再投射至单细胞和空间数据、细胞通讯和扰动分析为计算推断性质、空间转录组分辨率有限、以及DAPT非NOTCH3特异性。
