单细胞与空间转录组学揭示SERPINE1作为头颈鳞癌顺铂耐药的关键血管内皮介质

《Translational Oncology》：Single-cell spatial transcriptomics identifies SERPINE1 as a vascular endothelial mediator of cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma

：头颈部肿瘤是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中超过90%为头颈鳞状细胞癌（HNSCC）。尽管手术、放疗、化疗及免疫治疗等多模式综合治疗策略不断优化，HNSCC患者的总体生存率仍改善有限，其核心限制因素之一是治疗耐药的普遍存在。顺铂作为经典铂类化疗药物，仍是局部晚期及复发转移性HNSCC的一线治疗基础，但临床与基础研究均表明顺铂耐药在治疗过程中极为常见，显著削弱初始疗效，并与肿瘤复发、转移及不良预后密切相关。既往关于顺铂耐药的研究主要聚焦于肿瘤细胞内部的遗传与表观遗传改变，如DNA修复增强、药物外排增加及凋亡通路失活，但这些机制不足以完全解释临床观察到的耐药异质性。越来越多的研究开始认识到，肿瘤微环境作为肿瘤生长与治疗反应的重要调控方面，在化疗耐药的发生发展中同样发挥重要作用。人乳头瘤病毒（HPV）持续感染已被确认为HNSCC的独立危险因素，尤其在口咽癌中作用显著。与HPV阴性肿瘤相比，HPV阳性HNSCC在分子特征、免疫浸润模式及治疗反应方面均表现出显著差异，HPV阳性患者通常对放化疗及免疫治疗更为敏感，临床结局相对较好。然而，关于HPV状态如何通过调控肿瘤微环境（尤其是血管与基质相关组分）影响化疗耐药的发生与演变，仍缺乏系统性的多维研究证据。在肿瘤微环境耐药相关调控因子中，SERPINE1（纤溶酶原激活物抑制剂-1）近年来受到越来越多关注。既往研究表明，SERPINE1作为纤溶系统的关键调控因子，参与细胞外基质重塑、血管生成、肿瘤侵袭及治疗耐药，其异常表达与多种实体瘤的不良预后相关。新出现的证据进一步提示，SERPINE1相关的血管与基质重塑可能促成肿瘤灌注异常、缺氧维持、细胞外基质沉积及促生存信号激活，从而营造允许治疗耐药发生的微环境。然而，目前尚缺乏关于SERPINE1在HNSCC中具体细胞来源及空间定位特征的系统性单细胞与空间证据，也缺乏其是否通过肿瘤微环境（尤其是血管内皮细胞）介导顺铂耐药的关键科学证据。因此，本研究整合单细胞与空间转录组学分析，刻画SERPINE1在HPV阳性和HPV阴性HNSCC中的细胞起源与空间分布特征，并探讨其与内皮重塑、顺铂耐药相关表型及临床结局的潜在关联，为疾病的生物学理解、分子分层及耐药相关治疗策略的优化提供新的研究视角与理论基础。肿瘤内皮来源的SERPINE1是否在空间上协调顺铂耐药，在很大程度上仍属未知。

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一、研究背景与问题

头颈部肿瘤是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中超过90%为头颈鳞状细胞癌（HNSCC），主要发生于口腔、咽部（包括鼻咽、口咽和下咽）及喉部等解剖部位。根据GLOBOCAN最新统计数据，头颈部肿瘤的新发病例数和死亡率均位居全球恶性肿瘤前列，已成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题，对患者生活质量、社会劳动力及医疗资源均造成沉重负担。尽管近年来手术、放疗、化疗及免疫治疗等多模式综合治疗策略不断优化，HNSCC患者的总体生存率仍改善有限，其核心限制因素之一是治疗耐药的广泛存在。顺铂作为经典铂类化疗药物，仍是局部晚期及复发转移性HNSCC的一线治疗基础，其抗肿瘤作用主要通过形成DNA交联、诱导DNA损伤及凋亡来实现。然而，大量临床与基础研究表明，顺铂耐药在治疗过程中极为常见，显著削弱初始疗效，并与肿瘤复发、转移及不良预后密切相关。

既往关于顺铂耐药的研究主要集中于肿瘤细胞内部的遗传与表观遗传改变，如DNA修复增强、药物外排增加及凋亡通路失活等，但这些机制不足以完全解释临床观察到的耐药异质性。越来越多的研究开始认识到，肿瘤微环境作为肿瘤生长与治疗反应的重要调控方面，在化疗耐药的发生发展中同样发挥重要作用。近年来，人乳头瘤病毒（HPV）持续感染已被确认为HNSCC的独立危险因素，尤其在口咽癌中作用显著。与HPV阴性肿瘤相比，HPV阳性HNSCC在分子特征、免疫浸润模式及治疗反应方面均表现出显著差异，HPV阳性患者通常对放化疗及免疫治疗更为敏感，临床结局相对较好。然而，关于HPV状态如何通过调控肿瘤微环境（尤其是血管与基质相关组分）影响化疗耐药的发生与演变，仍缺乏系统性的多维研究证据。

在肿瘤微环境耐药相关调控因子中，SERPINE1（纤溶酶原激活物抑制剂-1）近年来受到越来越多的关注。既往研究表明，SERPINE1作为纤溶系统的关键调控因子，参与细胞外基质重塑、血管生成、肿瘤侵袭及治疗耐药，其异常表达与多种实体瘤的不良预后相关。新出现的证据进一步提示，SERPINE1相关的血管与基质重塑可能促成肿瘤灌注异常、缺氧维持、细胞外基质沉积及促生存信号激活，从而营造允许治疗耐药发生的微环境。然而，目前尚缺乏关于SERPINE1在HNSCC中具体细胞来源及空间定位特征的系统性单细胞与空间证据，也缺乏其是否通过肿瘤微环境（尤其是血管内皮细胞）介导顺铂耐药的关键证据。因此，开展本研究具有重要的科学意义与临床价值。

二、研究内容与结论

本研究整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学及多层次生物信息学分析，系统刻画了HNSCC中与顺铂耐药相关的细胞组成和空间分布特征，并探讨了这些细胞特征与肿瘤微环境之间的相互作用。通过顺铂耐药基因集评分、拟时序分析及细胞通讯网络构建，研究人员发现顺铂耐药相关信号并非主要来源于肿瘤上皮细胞，而是显著富集于肿瘤内皮细胞中，这一特征在HPV阴性肿瘤中尤为突出。该结果从单细胞和空间层面揭示了血管相关微环境在HNSCC顺铂耐药形成中的潜在核心作用，为耐药现象的细胞基础提供了新的认识。

研究人员进一步将内皮细胞重新注释为转录水平上不同的内皮亚型，并根据顺铂耐药评分中位数将细胞分为高耐药评分组和低耐药评分组。富集分析显示，高耐药评分内皮细胞优先富集于毛细血管内皮细胞（CapEC）和尖端细胞（Tip-cell）亚群中，提示顺铂耐药相关表型与血管生成或微血管内皮状态存在关联。高耐药评分内皮细胞表现出更高的CytoTRACE评分，与其较低分化程度的转录状态一致。SCENIC分析揭示高耐药评分内皮细胞显著表达促炎和促血管生成转录因子，如TEAD4、CLOCK、SMAD5和ILF2。拟时序分析将高耐药评分内皮细胞定位在推断轨迹的早期区域，提示顺铂耐药相关内皮状态可能在内皮状态转变过程中较早出现。代谢分析显示，高耐药评分内皮细胞在丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生相关通路中下调。

细胞通讯分析表明，高耐药评分内皮细胞在NK细胞中显著富集趋化因子信号通路，而Treg细胞表现出显著的HIF-1信号通路表达，提示顺铂耐药相关内皮状态与免疫细胞相互作用密切相关。配体热图分析显示，成纤维细胞和高耐药评分内皮细胞在TGF-β、FGF和DKK相关配体方面高表达，这些改变可能促进细胞外基质重塑和与顺铂耐药相关的保护性微环境形成。差异细胞通讯分析显示，高耐药评分内皮细胞与其他细胞之间的差异显著大于低耐药评分内皮细胞，WNT、APLN等是主要差异通路。当内皮细胞作为配体时，EDN1-EDNRA/B和TNFSF12-TNFRSF12A在高耐药评分内皮细胞、肥大细胞和浆细胞中显著富集，而IGFBP3-TMEM219在高耐药评分内皮细胞与免疫细胞亚群之间的通讯中显著富集。当内皮细胞作为受体时，TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)仅在高耐药评分内皮细胞中高表达。

为识别关键基因，研究人员将拟时序序列中前50个关键发育基因与顺铂耐药基因取交集，得到唯一交集基因SERPINE1。基因发育轨迹分析表明，CLOCK、TEAD4、ILF2和SERPINE1在高耐药评分内皮细胞中显著上调。Progeny分析显示，SERPINE1与缺氧、MAPK、NFkB和TGF-β显著正相关。根据内皮细胞中SERPINE1的表达水平，研究人员将内皮细胞分为SERPINE1阳性内皮细胞和SERPINE1阴性内皮细胞。SCENIC分析显示，SERPINE1阳性内皮细胞显著过表达PML和FOXO1等相关转录因子。功能富集分析显示，SERPINE1阳性内皮细胞在细胞外基质（ECM）、细胞黏附及PI3K-AKT相关通路中高表达。

三、主要技术方法

本研究基于公开数据库获取单细胞转录组数据，使用decontX去除环境污染，通过Harmony算法进行批次校正，采用t-SNE进行可视化，利用inferCNV进行肿瘤细胞鉴定，使用Monocle2进行关键亚群拟时序分析，并采用观测/期望比值（Ro/e）分析评估细胞状态富集程度。空间转录组学采用HPV阴性的HN48和HN47样本及HPV阳性的HN42和HN43样本。转录组数据及生存信息来自加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）数据库和GEO数据库的GSE65858数据集。顺铂耐药基因集来自HGSOC-Platinum数据库，采用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore五种方法进行单细胞评分。此外，研究人员还应用了SCENIC转录因子调控网络分析、CellChat细胞通讯分析、Nichenet蛋白互作分析、ESTIMATE免疫评分、IOBR免疫浸润分析、GSEA通路富集分析、CTRP和PRISM药物敏感性预测，以及qPCR和Western blot体外实验验证。

四、研究结果

1. 1.
   HNSCC单细胞图谱揭示肿瘤特异性细胞重编程

研究人员注释了数据并鉴定出15种细胞类型，包括CD8 T细胞、CD4 T细胞、增殖T细胞、NK细胞、B细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、树突状细胞、中性粒细胞、肥大细胞、浆细胞和上皮细胞。肿瘤与癌旁正常组织中各亚群存在显著表达差异，B细胞在肿瘤组织中显著耗竭，而上皮细胞、单核巨噬细胞和增殖T细胞在肿瘤样本中显著增加。inferCNV分析显示肿瘤样本中上皮细胞拷贝数变异显著增加，符合恶性上皮特征。

1. 2.
   HNSCC中内皮细胞相关的顺铂耐药特征

通过将顺铂耐药相关基因与HNSCC差异表达基因取交集，结合单因素Cox回归分析，研究人员鉴定出23个预后相关的顺铂耐药相关基因，主要富集于细胞黏附和ECM相关通路。在单细胞水平上，这些基因主要富集于上皮和基质 compartments。TCGA-HNSCC分析显示，高顺铂耐药评分的患者生存较差。单细胞评分显示内皮细胞和成纤维细胞中顺铂耐药相关活性相对较高。按HPV状态分层后，HPV阴性内皮细胞中耐药评分更高，而成纤维细胞无显著差异。肿瘤组织中的耐药评分高于癌旁正常组织。

1. 3.
   高顺铂耐药内皮细胞表现出独特的转录程序和免疫-基质相互作用

高耐药评分内皮细胞优先富集于CapEC和Tip-cell亚群，表现出较低分化程度的转录状态，显著表达TEAD4、CLOCK、SMAD5和ILF2等促炎和促血管生成转录因子，在拟时序轨迹中位于早期区域。代谢分析显示糖酵解相关通路下调。细胞通讯分析显示高耐药评分内皮细胞与免疫细胞存在显著通讯，成纤维细胞和高耐药评分内皮细胞高表达TGF-β、FGF和DKK相关配体。SERPINE1被鉴定为拟时序关键发育基因与顺铂耐药基因的唯一交集基因，与缺氧、MAPK、NFkB和TGF-β通路显著正相关。

1. 4.
   SERPINE1在HNSCC中的预后意义和免疫抑制角色

TCGA-HNSCC分析显示SERPINE1在肿瘤组织中显著过表达。在TCGA和GSE65858数据集中，SERPINE1高表达患者预后较差，1-3年AUC曲线显示其具有一定预后预测价值。免疫浸润分析显示，SERPINE1与CD4 Tcm、NK和肥大细胞负相关，与APM信号通路正相关。SERPINE1高表达组的免疫细胞富集显著低于低表达组，ESTIMATE评分显示高表达组具有更高的ESTIMATE和Stromal评分，肿瘤纯度相对较低。泛癌免疫浸润分析显示，SERPINE1在HNSCC中与T细胞浸润呈负相关。Submap分析显示SERPINE1高表达患者免疫治疗反应较差。药物敏感性预测显示，SERPINE1高表达组对afatinib、canertinib、dasatinib、gefitinib、cobimetinib和trametinib等靶向药物具有更高的预测敏感性。

1. 5.
   空间转录组定位与相关性分析

空间转录组分析显示，在HPV阴性肿瘤样本（HN48、HN47）中，SERPINE1表现出明显的区域性高表达，其空间分布与VWF和PECAM1标记的血管结构高度重叠，主要富集于血管相关区域。在HPV阳性肿瘤样本（HN42、HN43）中，SERPINE1总体表达水平较低，空间分布较为分散，与血管标记基因的共定位趋势减弱。定量分析显示，HPV阴性样本中SERPINE1在恶性区和混合区的表达显著高于正常区，而HPV阳性样本中差异不再显著。细胞来源分析显示，HPV阴性样本中SERPINE1与内皮细胞和成纤维细胞显著空间相关，与上皮细胞相关性较弱；HPV阳性样本中SERPINE1与各细胞类型的相关性整体减弱。

1. 6.
   HNSCC细胞中SERPINE1表达的实验验证

为验证生物信息学发现，研究人员使用HaCaT（正常上皮细胞）和FaDu（HNSCC细胞）进行体外实验。qPCR分析显示肿瘤细胞中SERPINE1转录水平显著升高（P<0.01），Western blot分析确认蛋白表达升高（P<0.01），与计算分析结果一致。

五、讨论与结论

本研究表明，SERPINE1并非作为肿瘤细胞中普遍上调的内在耐药分子发挥作用，而是特异性标记了一类与顺铂耐药相关的肿瘤内皮细胞状态。单细胞分辨率分析证明SERPINE1的主要表达来源是肿瘤相关内皮细胞，其空间分布紧密围绕血管结构，在HPV阴性HNSCC中尤为突出。这一发现提示，SERPINE1相关的耐药效应可能更准确地反映了血管微环境的变化，而非肿瘤细胞获得性耐药程序的直接激活。高表达SERPINE1的内皮细胞可能代表一种功能重编程的血管亚状态，其特征是细胞外基质重塑增强、血管结构异常及多种促生存信号通路的协同激活。在此背景下，顺铂耐药可能并非直接源于肿瘤细胞逃避药物诱导损伤，而是源于异常血管和基质导致的药物递送受限及局部保护性微环境的形成。以内皮细胞为中心的耐药调控模型为HPV阴性肿瘤中更顽固的顺铂耐药现象提供了合理解释，也提示不同HPV状态下治疗反应的差异可能部分源于血管微环境的功能差异。

本研究也存在一定局限性。首先，研究结果主要基于公共数据集和计算分析，单细胞和空间转录组分析本质上是观察性的，无法建立SERPINE1表达与顺铂耐药之间的因果关系。内皮特异性扰动实验（包括SERPINE1敲低或过表达联合顺铂反应测定及内皮-肿瘤共培养模型）将有助于建立因果关系。未来整合功能基因组学方法（如基于CRISPR的扰动筛选和扰动解析的单细胞分析）可能进一步识别SERPINE1的上游调控因子和下游效应因子。

研究结论：本研究将SERPINE1的内皮特异性富集确定为HNSCC中与顺铂耐药相关表型相关的关键特征，尤其在HPV阴性肿瘤中。这些发现凸显了血管微环境驱动的耐药模式，并为未来验证内皮靶向治疗策略提供了理论依据。