透明细胞肾细胞癌转移相关的长链非编码RNA LINC01354与LINC01510 DNA甲基化研究

《Clinical Epigenetics》：Metastasis-associated DNA methylation of the lncRNAs LINC01354 and LINC01510 in clear cell renal cell carcinoma

摘要 背景：长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）调控多种细胞过程，并参与包括肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）在内的人类癌症的发生与发展。 方法：研究人员采用Illumina EPIC芯片进行全基因组DNA甲基化谱分析，以鉴定与转移性RCC相关的差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMR）。通过焦磷酸测序法在145例原发性RCC组织、124例配对肿瘤旁正常组织（tumor-adjacent normal tissues, adNs）以及来自101例转移性RCC患者的194例转移组织样本中对LINC01354与LINC01510内的候选位点进行了验证。此外，研究人员对癌症基因组图谱肾透明细胞癌数据集（The Cancer Genome Atlas Kidney Renal Clear Cell Carcinoma Collection, TCGA-KIRC）进行了计算机模拟分析，以评估DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）的临床相关性及其与基因表达的关系。 结果：两个位点所有被分析CpG位点的超甲基化与高分期（≥T3；p = 0.001）和高分级（≥G3；p = 0.003）RCC相关，且在转移组织中较局限性原发肿瘤显著升高（p < 0.001）。此外，伴有远处转移（M+）患者的原发肿瘤在LINC01510内的PS_307-CG1位点显示出显著高于无远处转移（M0）患者肿瘤的甲基化水平（p = 0.031）。对TCGA-KIRC数据的分析证实了甲基化升高与不良临床病理特征及基因表达降低之间的关联，支持其潜在的表观遗传沉默作用。 结论：本研究数据通过证明LINC01354与LINC01510位点存在肿瘤及转移相关的超甲基化，进一步揭示了与RCC进展相关的表观遗传改变。超甲基化与晚期疾病及转移组织的关联，以及甲基化与表达之间观察到的负相关关系，提示这些lncRNAs的表观遗传失活可能促进RCC进展。因此，这些位点的DNAm可能作为侵袭性疾病潜在的生物标志物。

论文解读：透明细胞肾细胞癌中LINC01354与LINC01510的转移相关DNA甲基化研究

一、研究背景与问题

肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是全球十大常见癌症之一，其发病率持续上升。透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是最常见的组织学亚型，约占所有RCC病例的75%。尽管以免疫检查点抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂为代表的新型系统治疗显著改善了晚期RCC患者的预后，缺氧诱导因子2α（hypoxia-inducible factor 2 alpha, HIF-2α）抑制剂belzutifan的出现也为治疗提供了新的选择，但临床上仍然缺乏经过验证的、可用于个体化治疗选择的预测性生物标志物。超过25%的RCC患者在初诊时即已出现转移，这凸显了识别临床相关生物标志物和可靶向分子通路的迫切性。

在分子层面，ccRCC的发生以遗传和表观遗传改变为特征。VHL肿瘤抑制基因的突变或表观遗传失活导致HIF信号通路激活，是ccRCC发生的主要驱动因素。此外，位于3号染色体短臂上的PBRM1、BAP1和SETD2等肿瘤抑制基因也频繁发生改变。长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）调控包括增殖、侵袭和转移在内的多种癌症发生发展相关细胞过程。在RCC中，lncRNAs的表达改变与表观遗传失调相关，包括非编码RNA位点的超甲基化或低甲基化。LINC01354位于1号染色体，在胃癌、结直肠癌、肺癌和骨肉瘤等多种肿瘤中发挥致癌功能；LINC01510又称COMETT，位于7号染色体，在RCC、结直肠癌、肺癌和甲状腺乳头状癌中均有涉及，但其表达和生物学效应具有背景依赖性。然而，LINC01354和LINC01510位点在RCC中的DNA甲基化改变此前尚未被描述。

二、研究目的与主要发现

本研究旨在通过全基因组DNA甲基化谱分析鉴定与转移性RCC相关的差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMR），并在独立队列中验证候选位点，评估其临床相关性及与基因表达的关系。研究发现，LINC01354和LINC01510两个位点的超甲基化与高分期和高分级RCC显著相关，且在转移组织中较局限性原发肿瘤显著升高。TCGA-KIRC数据分析证实了甲基化升高与不良临床病理特征及基因表达降低之间的关联。这些发现扩展了RCC中lncRNA位点表观遗传改变的证据，提示这些lncRNAs的表观遗传失活可能促进RCC进展，其DNAm可能作为侵袭性疾病的潜在生物标志物。

三、关键技术方法

研究人员首先采用Illumina EPIC甲基化芯片对22例无远处转移（M0）和22例有远处转移（M+）的原发性ccRCC进行全基因组DNA甲基化谱分析，通过bumphunter算法鉴定DMR。随后设计三个焦磷酸测序检测体系（PS_301、PS_306、PS_307），在145例原发性RCC组织、124例配对肿瘤旁正常组织（adNs）和来自101例转移性RCC患者的194例转移组织样本中进行独立验证。此外，研究人员利用TCGA-KIRC数据集进行计算机模拟分析，评估DNAm的临床相关性及其与基因表达的关系，并查询RNAInter数据库分析lncRNA的调控特征。

四、研究结果

1. DNA谱分析鉴定候选CpG位点及焦磷酸测序验证

全基因组DNA甲基化谱分析在M0和M+原发性ccRCC中鉴定出10个FWER值≤0.03的候选DMR，其中两个位于LINC01510（排名第1；FWER < 0.001）和LINC01354（排名第4；FWER = 0.025）位点内。两个候选DMR内的CpG位点在M+原发性RCC中均表现出显著高于M0肿瘤的中位DNAm水平。

2. 细胞系模型中LINC01354和LINC01510相关CpG甲基化分析

在18种细胞模型（包括RPTEC、PrEC、6种RCC细胞系、3种前列腺癌细胞系、6种尿路上皮癌细胞系和1种宫颈癌细胞系）中，RCC细胞和宫颈癌细胞普遍表现出高甲基化水平（50–98%），而前列腺和尿路上皮癌细胞系则表现出更大的变异性。

3. 肿瘤旁正常组织和原发肿瘤组织中的超甲基化分析

在124对配对adNs和对应肿瘤组织中，8个被分析CpG位点中有2个（PS_306_CG1和PS_306_CG2，均位于LINC01510内）表现出显著超甲基化，但效应量较小。配对条带图显示LINC01354的所有CpG位点均表现出异质性，相当一部分组织对在肿瘤中表现出中度低甲基化或更明显的超甲基化效应。

4. 侵袭性原发癌中LINC01354和LINC01510的超甲基化

肿瘤组比较显示，仅PS_307-CG1在M+肿瘤中表现出显著高于M0肿瘤的甲基化水平（OR 1.04，p = 0.031）。然而，低分期与高分期肿瘤的比较显示，所有CpG位点在高分期肿瘤中均表现出显著超甲基化（OR 1.03–1.05，所有p = 0.001）。同样，高分级肿瘤也与所有被检测位点的更高甲基化相关（OR 1.03–1.05，所有p = 0.003）。年龄和性别协变量在任何肿瘤组比较中均未表现出显著效应。

5. LINC01354和LINC01510的转移组织特异性超甲基化

与局限性原发RCC组织相比，RCC转移组织在所有候选位点均表现出显著更高的甲基化水平。统计分析显示每增加1%甲基化的比值比为1.05–1.09（所有p值 < 0.001），组间平均甲基化值差异约为25–30个百分点。LINC01510位点表现出最显著的转移相关超甲基化效应。

6. TCGA-KIRC项目中LINC01354相关CpG位点的计算机模拟分析

TCGA-KIRC数据中鉴定出一个共享CpG位点（cg21546522）及其5'端100 bp内的两个相邻位点（cg19856705和cg10811426），其超甲基化与几乎所有不良临床和疾病结局参数相关，包括远处转移状态、高分期和高分级ccRCC。三个位点在单变量分析中均与总生存期高度显著相关，cg19856705和cg21546522在多变量Cox回归分析中也具有显著性。

7. LINC01354 DNAm与mRNA表达的相关性分析

TCGA-KIRC分析显示，cg10811426、cg19856705和cg21546522三个CpG位点的甲基化与LINC01354 mRNA表达在adNs和肿瘤组织组中均呈显著负相关，肿瘤组织中相关系数R介于?0.41至?0.51之间，adNs中为?0.50至?0.59。

8. LINC01354和LINC01510调控特征的计算机模拟分析

RNAInter数据库分析显示，LINC01354、LINC01510和LINC00404三个lncRNAs共享大部分与蛋白质和表观遗传修饰组蛋白的相互作用。通路富集分析显示，参与原肠胚形成、粒细胞生成调控、SUMO化、RUNX1转录调控和PD-L1调控的基因显著富集。TCGA-KIRC分析显示，相当一部分假定靶蛋白在高分期或转移性RCC中表现出显著表达改变，且其中大部分表现为表达缺失。

五、讨论与结论

本研究发现LINC01354和LINC01510位点存在肿瘤和转移相关的超甲基化，扩展了ccRCC中lncRNA位点表观遗传改变的现有证据。与先前鉴定的LINC00404和miR124-3不同，LINC01354和LINC01510内的DMR是通过DNA甲基化谱分析的全新搜索鉴定出来的，其中7个候选CpG位点未被TCGA-KIRC项目使用的HM450K芯片覆盖。转移组织中观察到的显著超甲基化支持其与已确立的转移性疾病相关，但原发M0和M+肿瘤之间较不一致的差异不能为转移风险提供预测价值。TCGA-KIRC分析证实了LINC01354甲基化与不良临床特征和降低的基因表达相关，支持其潜在的表观遗传沉默作用。RNAInter数据库分析揭示这三个转移相关lncRNAs共享大量相互作用靶标，提示可能存在共同的调控网络。

本研究的主要局限性在于其观察性设计，统计关系不能确定DNAm、lncRNA表达和疾病进展之间的因果关系。未来研究应确认功能相关性，并阐明LINC01354和LINC01510的DNAm是否能够改进现有预后模型和患者结局预测。