高密度CMOS MEA平台在骨关节炎相关软骨细胞动态的单细胞分辨率映射中的应用

《Advanced Healthcare Materials》：Single-Cell Resolution Mapping of Osteoarthritis-Associated Chondrocyte Dynamics Using a High-Density CMOS MEA Platform

纤维化是慢性组织功能障碍的主要原因，并在全球范围内显著增加发病率和死亡率。影响超过5.9亿人的骨关节炎（OA）是一种常见的纤维化关节疾病，目前仍缺乏疾病修饰疗法，部分原因在于疾病进展尚未被完全理解。随着包括器官芯片和微生理系统在内的与人相关的体外模型日益重要，迫切需要能够连续监测细胞的非侵入性技术。在此，研究人员将高密度互补金属氧化物半导体（CMOS）多电极阵列（MEA）阻抗分析作为一种无标记平台，用于骨关节炎相关软骨细胞重塑的纵向评估。在CMOS-MEA芯片上培养的人原代软骨细胞表现出与电极占用率和细胞外基质（ECM）沉积相关的阻抗增加。空间阻抗映射能够可视化损伤反应动态，而氧化应激诱导进行性阻抗下降，并伴随细胞凋亡、形态重塑和软骨细胞去分化，表现为II型胶原和SOX9表达降低以及I型胶原表达增加。相反，成骨性去分化产生与ECM重塑和基质矿化相关的阻抗增加。总之，这些发现支持高密度CMOS-MEA阻抗分析作为一种监测细胞重塑的非侵入性方法，并为未来将空间分辨阻抗传感整合到用于OA及其他纤维化疾病的先进微生理系统中奠定了基础。

本研究聚焦于骨关节炎（osteoarthritis, OA）这一影响全球超过5.9亿人的纤维化关节疾病，其疾病修饰疗法的缺乏部分归因于疾病进展机制尚不明确。随着与人相关的体外模型（如器官芯片和微生理系统）日益重要，现有模型依赖破坏性终点检测，无法对同一生物系统进行连续纵向评估，缺乏集成非侵入性监测技术。为弥补这一技术缺口，研究人员探讨了高密度互补金属氧化物半导体（CMOS）多电极阵列（MEA）平台作为无标记、非侵入性工具，在空间和单细胞分辨率下动态监测OA相关软骨细胞重塑的可行性。研究发现，该平台能够通过阻抗分析追踪细胞增殖、迁移、黏附、氧化应激反应、细胞外基质重塑及成骨性去分化等多种生物学过程，并获得了与分子标志物变化相一致的阻抗特征。该研究发表于《Advanced Healthcare Materials》，为将空间分辨阻抗传感整合入微生理系统、推动OA及其他纤维化疾病的机制研究和药物发现奠定了基础。

研究人员主要采用了高密度CMOS-MEA芯片进行固定频率阻抗测量和阻抗谱分析，并结合荧光显微镜、免疫细胞化学、活/死细胞活力测定、苦味酸-天狼星红染色、茜素红染色及PrestoBlue代谢活性检测等多种正交验证手段。人原代关节软骨细胞（购自Innoprot）被培养于CMOS-MEA芯片上，通过定制图像分析流程将荧光定位的细胞映射至底层电极，实现单细胞水平阻抗计算。此外，通过划痕实验、EDTA介导的细胞脱落与再附着实验、过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激模型以及成骨分化培养基处理，系统评估了阻抗信号对不同细胞动态过程的响应。

2.1 无标记阻抗监测揭示软骨细胞增殖和生长动态
通过不同接种密度实验，发现阻抗值随细胞覆盖率和代谢活性增加而升高；13天纵向监测显示，阻抗在汇合后仍持续增加，与胶原纤维沉积趋势一致。单细胞阻抗映射显示阻抗值呈Gamma分布，且与细胞投影面积无相关性，表明阻抗反映综合细胞状态而非单纯细胞大小。

2.2 时空阻抗映射实现伤口闭合和动态细胞-底物相互作用的实时监测
划痕实验中，受损区域阻抗立即下降，随后随时间逐渐恢复，与细胞迁移再定植过程一致；相邻未划痕区域出现短暂阻抗下降，反映细胞向伤口区的动态重分布。EDTA处理导致阻抗急剧下降，去除EDTA后阻抗逐渐恢复，证实阻抗可敏感反映细胞黏附动力学变化。

2.3 时空阻抗映射揭示氧化应激诱导的细胞重塑
以5% DMSO作为阳性对照，观察到阻抗随细胞脱落和凋亡逐渐下降。1.5 mM H₂O₂处理模拟急性氧化应激，导致阻抗时间依赖性降低，同时伴随细胞面积减小、形态变圆和活力显著下降（1小时和4小时活力分别降至55.6%和21.1%）。低频慢性ROS暴露（150 μM）24小时亦导致1 kHz以上频率阻抗降低。

2.4 氧化应激诱导的分子重塑与纵向阻抗变化相对应
ROS处理后，软骨细胞II型胶原（COL2）表达下调、I型胶原（COL1）表达上调，SOX9总表达量下降；亚细胞定位分析显示，ROS处理后1小时SOX9出现核转位，4小时后核定位减弱并重新分布至胞质。这些分子变化与阻抗降低趋势在时间上吻合。

2.5 生物电映射检测软骨细胞成骨重编程中的基质矿化相关重塑
在成骨分化培养基处理7天后，软骨细胞COL2下调、COL1上调，茜素红染色证实基质矿化启动，同时阻抗值持续显著升高，表明阻抗增加是成骨表型转变、ECM重塑和矿化共同作用的复合信号。

讨论部分指出，高密度CMOS-MEA阻抗分析提供的连续非侵入性电学读数，与OA相关表型重塑平行演进，整合了细胞覆盖、黏附、ECM、形态和活力等多重参数，而非单一生物学过程。与依赖群体平均信号的商业系统相比，该平台具备单细胞和空间分辨率优势。研究验证了阻抗在监测迁移、黏附、应激反应、去分化及矿化等方面的广泛适用性，并将其扩展至其他纤维化及慢性炎症疾病。研究也承认当前二维模型和静态ROS浓度的局限性，指出未来需结合实时成像、计算建模和机器学习，并向三维微生理系统集成推进。结论部分强调，CMOS MEA技术为骨关节炎病理生物学的基础研究、治疗筛选和疗效评估提供了强大工具，并为整合入体外模型实现空间和单细胞分辨率的动态细胞变化映射奠定了基础。