灌流细胞培养技术：生物制药生产中值得投入的技术吗？

《ChemBioEng Reviews》：Perfusion Cell Cultures: Is the Technology Worthwhile for Biopharmaceutical Production?

生物制药需求的持续增长、来自市场的日益加剧的压力以及压缩工艺开发时间的必要性，构成了当前生物制药生产领域的主要挑战。传统的间歇式生物反应器已逐渐显现出过时性，难以应对上述挑战。另一方面，灌流培养（perfusion culture）已被报道为颇具前景的替代方案，能够缓解批次间差异性并提高体积产率（volumetric yield）。然而，工业惯性、较高的投资成本要求以及系统复杂性的增加，仍是制约该操作向生产平台规模化放大的挑战。本综述旨在解构复杂的灌流工艺问题，并审视该技术可能带来的潜在优势。本综述从基本操作原理出发，概述了最新的应用进展，内容涵盖灌流培养的经济性评估、环境可持续性分析以及与先进监测技术的集成。最后，本文讨论了现存的技术障碍以及克服当前工业采用惯性的可行路径。

主体内容总结

1 引言

生物制药工业依赖利用活微生物的制造工艺来生产多种治疗药物和疫苗，包括重组蛋白、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）、多肽、血液制品以及细胞和基因治疗产品。截至2023年，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准超过600种生物制品，2024年全球市场总值达4800亿美元，预计2030年将达7450亿美元，复合年增长率（compound annual growth rate, CAGR）为9%–10%。目前大多数生物治疗药物采用间歇或半连续工艺生产，如批式或补料分批（fed-batch）生物反应器。然而，生物制药行业具有高度保守性，这主要源于严格的监管框架和高经济收益。但不断增加的批准数量、监管机构推动药物质量与安全的举措、生物类似药带来的市场竞争压力、长期成本效益需求以及降低碳足迹和环境影响的必要性，均凸显了发展面向工业4.0的替代生产流程的紧迫性。在此背景下，连续单元操作可能解决上述问题。灌流生物反应器能够在稳态下以高细胞浓度运行，其典型配置包括配备搅拌桨和气体供应装置的反应器容器，并通过细胞截留装置（cell retention device, CRD）实现细胞与可溶性组分的分离。从历史角度看，灌流技术最初仅用于少数对降解敏感的生物治疗药物，如不稳定酶、血液因子和蛋白质。1993至2014年间，244种新批准的生物制品中仅有22种采用灌流工艺。高额的设备投资、复杂的工艺开发、缺乏先验知识以及补料分批系统的持续改进，限制了灌流技术的推广。然而，灌流系统具有多项优势：降低碳足迹、提高操作灵活性、与下游加工（downstream process, DSP）集成实现端到端连续制造。美国FDA提出的过程分析技术（process analytical technology, PAT）和基于质量的设计（quality by design, QbD）倡议也进一步推动了向连续灌流技术的转型。

2 灌流生物反应器基本原理

灌流生物反应器是由培养容器和CRD两个连接单元组成的先进细胞培养系统。连续培养基供应以灌流速率（perfusion rate, P）表征，确保提供新鲜营养物质；无细胞收获流通过CRD排出，实现产品连续回收并防止代谢物积累；排放流（bleed stream）用于调控反应器内细胞密度，实现稳态操作。与间歇式生物反应器不同，灌流系统在稳态阶段的限制因素包括细胞稳定性、氧传质速率（oxygen transfer rate, OTR）以及CRD中的产品筛分效率。CRD可采用不同物理原理设计，包括超声声学方法、斜板重力沉降、水力旋流器以及3D打印微流控螺旋分离器等。目前，基于中空纤维的错流过滤装置，即交替切向流（alternate tangential flow, ATF）和切向流过滤（tangential flow filtration, TFF），仍是各规模下最广泛使用的CRD技术。ATF通过隔膜泵产生交替正负压循环，实现双向流动，从而降低细胞剪切应力、减少膜污染并提高细胞活率。在数学模型方面，灌流生物反应器可视为连续搅拌釜反应器（continuous stirred tank reactor, CSTR），其关键操作参数包括灌流速率（P）和细胞特异性灌流速率（cell-specific perfusion rate, CSPR），后者定义为P与活细胞浓度（viable cell concentration, VCC）之比，单位为pL/cell/day。CSPR影响平均停留时间、底物和产物设定水平以及主要关键性能指标（key performance indicators, KPIs），包括体积生产率（productivity, PR）、工艺收率（yield, Y）和培养基消耗（medium consumption, MC）。工艺强化研究旨在确定最小CSPR（CSPR_min），可采用push-to-low方法（在恒定最大VCC下逐步降低灌流速率）或push-to-high方法（在恒定灌流速率下逐步提高VCC）。在小型化工具方面，深孔板（deep-well plates, DWP）、商品化微型生物反应器（如Merck Mobius Breez）、50 mL TPP旋管（spin tubes, ST）、125 mL摇瓶以及微型搅拌罐（如Sartorius Ambr15和Ambr250 HT）等设备被广泛用于克隆筛选、培养基优化和工艺参数筛选，以在降低成本和缩短时间的前提下获取可靠的工艺信息。

3 灌流细胞培养在生物制药中的当前应用与未来趋势

3.1 单克隆抗体

治疗性mAbs属于免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）家族的糖蛋白，广泛用于治疗感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病。mAb生产占全球生物制药生产的50%，2023年市场份额约2250亿美元，预计2032年达6400亿美元。灌流生物反应器通常作为高细胞密度（high cell density, HCD）种子链或直接作为工业规模连续生产步骤。作为种子链策略，Olin等人开发的基于电容控制的N?1灌流系统与强化补料分批工艺耦合，相比低细胞密度（low cell density, LCD）工艺，平均滴度和时空产率（space-time yield, STY）分别提高85%和130%。Zhang等人比较了三种种子扩增策略，在16天培养内将产物滴度提升至24 g/L。作为生产策略，Ott等人在中试规模开发并比较了补料分批和灌流培养，后者稳定运行超过50天，生产率提高3倍，平均STY达1 g/L/day。Schwarz等人开发的30 L连续培养直接连接下游工段，运行25天，产物质量保持一致。然而，灌流技术仍面临监管机构对产品质量的更高要求以及当前间歇式DSP在处理大体积和高滴度方面的局限性等挑战。

3.2 疫苗

疫苗是能够触发先天免疫反应并刺激抗原特异性反应的生物制剂。2024年全球疫苗市场规模约780亿美元。悬浮细胞培养仍是重组疫苗生产的主要方式。Zinnecker等人实现了两种细胞系的灌流悬浮培养用于流感A病毒生产强化，相比批式参考工艺，两种毒株的STY均提高至少4倍。该团队还探索了N?1灌流种子链优化以及高细胞密度细胞库的冷冻保存。其他研究同样表明，通过提高VCC可提升细胞特异性生产率和系统收率。然而，疫苗生产的瞬时特性对灌流策略的应用提出了额外挑战，目前研究聚焦于深度细胞筛选、优化培养基配方和定制化补料方案等方向。

3.3 基因治疗产品

基因治疗市场预计从2023年的70亿美元增长至2032年的370亿美元。常见的体内给药方式包括利用病毒载体如腺病毒（adenovirus, AdV）、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）和慢病毒（lentivirus, LV），或非病毒递送系统如脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）。病毒载体生产主要依赖瞬时转染或稳定工程细胞系两种途径。灌流策略可适应病毒载体生产的多方面需求，既可在N?1或N反应器中提升转染/感染前的VCC，也可建立稳定生产细胞宿主的连续表达系统。Nie等人采用基于实验设计（design of experiments, DoE）的优化方法，在高细胞密度下开发灌流工艺，获得7×10¹¹ vg/mL的病毒基因组滴度。Deng等人利用灌流技术在20 mvc/mL的稳定HEK293细胞培养中，在摇瓶和台式生物反应器中均实现约10¹² vg/mL的滴度。Klimpel等人通过强化灌流操作实现高VCC下LV的连续生产，体积生产率提高约3倍，并在2 L台式生物反应器中验证了结果。Tona等人利用切向流深层过滤（tangential flow depth filtration, TFDF）装置实现LV的连续收获。然而，多数证据仍停留在实验室或台式规模，可放大性、长期稳健性和跨平台可转移性仍是工业实施的关键挑战。

3.4 其他治疗模式

3.4.1 细胞治疗

细胞治疗利用自体或异体细胞进行治疗，主要包括间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）疗法和嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T, CAR-T）细胞疗法。2024年全球细胞治疗市场约60亿美元，预计2030年达200亿美元。灌流生物反应器通过连续培养基补充、有毒代谢物去除和高细胞密度培养，可改善工艺收率并降低成本。近期研究在实验室规模实现了人MSCs微载体灌流培养20倍扩增，体积生产率较标准平面培养提高4倍。在CAR-T细胞生产中，基于QbD的DoE分析评估了灌流启动时间和培养基交换率等关键变量，优化后可在更短时间内从更低接种密度收集超过20×10⁶ CAR-T cells/mL。Springuel等人开发了小型和台式灌流系统，在2 L灌流搅拌罐中实现约125倍细胞浓度增加，获得25×10⁶ cells/mL，相当于超过300个代表性剂量。然而，供体间变异性、细胞质量和表型维持、补料策略优化及工艺控制等问题仍限制着一致且可转移工艺的实现。