基于CRISPR/Cas12a的USP26簇变体快速灵敏检测

《HUMAN MUTATION》：Rapid and Sensitive Detection of USP26 Cluster Variants Based on CRISPR/Cas12a

已报道USP26基因变体与男性不育相关，如非梗阻性无精子症（NOA）、少精子症和畸形精子症，并可能与精子性染色体分离模式改变有关。在已报道的变体中，USP26簇变体（c.370_371insACA/c.494T>C/c.1423C>T）是某些人群中常见报道的变体模式。对USP26簇变体进行快速便捷的检测可成为男性不育相关队列研究的有效工具。研究人员开发了一种基于CRISPR/Cas12a的检测方法，用于快速检测人类样本中的USP26变体。筛选并优化了候选CRISPR RNA（crRNA）和重组酶聚合酶扩增（RPA）引物，并引入限制性内切酶以减少野生型来源扩增干扰。在受控的人工DNA混合物中，该方法在测试条件下可检测低至5%的突变模板比例。整个流程可在60分钟内使用基础实验室设备完成。在91份男性不育研究样本中，CRISPR/Cas12a系统结果与Sanger测序一致。总之，该研究建立了一种快速检测USP26簇变体的分子检测方法，并为男性不育相关队列的遗传学研究提供了替代方案。

论文解读

**研究背景与目的**

男性不育约占全球不孕不育的一半，患病率上升构成重要的公共卫生负担。USP26是位于X染色体上的基因，编码去泛素化酶，其变体已被报道与男性不育相关表型有关，包括非梗阻性无精子症（NOA）、少精子症和畸形精子症。其中，USP26簇变体（c.370_371insACA/c.494T>C/c.1423C>T）是某些人群中较常见的变体模式。近期研究提示，携带USP26簇变体的男性可能比不携带者表现出更高比例的XY非整倍体精子，但其与Klinefelter综合征（KS；47,XXY）风险的关系仍需进一步研究。目前的基因分型方法包括PCR检测、一代测序（Sanger测序）和二代测序（NGS），但这些方法可能存在周转时间长、成本高或对特定变体快速检测灵活性有限等问题。因此，需要同时具备分析性能与操作简便性的检测策略。CRISPR相关系统因其快速、序列特异的核酸检测能力而成为有力的分子检测平台；RPA可在等温条件下实现靶标富集，但残留的野生型（WT）DNA干扰可能降低突变信号的辨别能力。为应对WT模板干扰，研究人员前期开发了Excision-amplification-synchronous Cas12a-targeted checkout（EasyCatch）平台，将限制性酶切整合到RPA-Cas12a流程中，以减少WT来源扩增干扰。本研究将这一框架扩展到USP26簇变体，建立目标特异的检测方法。

**研究内容与总体结论**

研究人员针对USP26三个簇变体从头设计和优化了变体特异性crRNA和RPA引物，对两个单核苷酸变体引入位点特异的限制性内切酶辅助抑制WT来源扩增，建立了免提取的血液处理流程，并利用男性不育研究样本评估了优化后的检测方法。优化后的CRISPR/Cas12a检测可在约60分钟内完成，仅需基础实验室设备。在91例男性不育研究样本中，CRISPR/Cas12a检测结果与Sanger测序完全一致。该研究为男性不育相关队列中USP26簇变体的遗传研究提供了一种快速、可靠的替代工具。

**关键技术方法**

样本来自北京大学第三医院生殖医学中心连续招募的91例男性不育患者，其中17例为弱精子症，74例为NOA，未纳入生育力对照。研究人员采用红细胞裂解液处理外周血，结合核酸释放试剂获得基因组DNA（gDNA），省略了传统柱提取步骤。针对三个变体设计并筛选crRNA和RPA引物；对于c.494T>C和c.1423C>T，分别在RPA反应起始时加入限制性内切酶MluCI或BtsCI，使酶切与扩增同时进行，选择性抑制WT来源扩增。经37°C RPA 25分钟后，加入Cas12a/crRNA复合物和荧光-淬灭单链DNA（ssDNA）报告分子，37°C反应20分钟，最终在485 nm蓝光透射仪下判读终点荧光。使用人工DNA混合物评估突变模板比例检测能力，并以Sanger测序作为参照方法。

**研究结果**

3.1 建立基于CRISPR的USP26簇变体检测体系

研究人员建立了从血液处理到结果判读的完整流程，包括血液处理、gDNA释放、等温扩增、Cas12a反应和荧光判读五个步骤。RPA在37°C恒温条件下扩增覆盖三个USP26簇变体的基因组区域，Cas12a识别变体扩增子后启动非特异性ssDNA酶切活性，切割荧光标记的ssDNA报告分子并释放荧光信号。整个流程从样本采集到结果可在60分钟内完成，所需设备为基础实验室常规设备。

3.2 变体特异性crRNA的设计与优化

研究人员针对每个USP26簇变体设计多个候选crRNA，并引入错配crRNA以降低与WT序列的交叉反应。利用10¹⁰拷贝的突变或WT DNA片段评估其性能。对于c.370_371insACA位点，crRNA2（cr2）产生的靶特异性荧光信号最强；对于c.494T>C位点，crRNA3（cr3）表现最佳；对于c.1423C>T位点，多个候选crRNA因与WT靶标明显交叉反应而被排除，最终选择cr3用于后续优化。

3.3 RPA引物筛选与灵敏度分析

研究人员系统筛选RPA引物对。c.370_371insACA筛选出F2R3引物组合，c.494T>C筛选出F3R3，c.1423C>T在固定反向引物R1的条件下筛选出F4R1。R1反向引物被专门设计为向扩增子中引入Cas12a/crRNA识别所需的PAM序列。三个位点的荧光信号均呈现模板拷贝数依赖型增加；c.370_371insACA和c.494T>C可检测低至10拷贝的靶DNA，c.1423C>T在测试条件下可检测10³拷贝。

3.4 限制性内切酶增强特异性与降低WT干扰

对于两个单核苷酸变体c.494T>C和c.1423C>T，在60分钟监测期间观察到残留的WT模板交叉反应。为改善突变与WT模板的区分，研究人员采用EasyCatch限制性内切酶辅助策略。MluCI（≥10 U）加入c.494T>C检测的RPA体系后，有效抑制WT c.494T模板扩增，而突变阳性模板在10–500 ng gDNA范围内仍可高效扩增并产生强荧光信号。BtsCI（≥10 U）同样使c.1423C>T检测能够特异性识别突变模板，并在测试条件下未出现来自WT对照的可检测假阳性荧光。c.370_371insACA位点本身未观察到明显WT交叉反应。

3.5 分析检测能力评估

研究人员通过将突变型与野生型gDNA混合制备含100%、50%、25%、10%和5%突变模板比例的人工DNA混合物。在三个位点中，最低测试的5%突变模板比例均可观察到清晰可辨的荧光信号。由于未评估低于5%的突变模板比例，该结果不被定义为正式的分析检测限，而是表明优化后的检测方法在测试条件下能够检测5%突变模板比例。

3.6 男性不育研究样本中的检测评估

研究人员比较了不同核酸释放时间与试剂体积，确定20 μL核酸释放试剂与5分钟裂解时间组合在流程时间和荧光信号强度之间达到最佳平衡。利用优化流程检测91份血液DNA样本，其中弱精子症17例、NOA 74例。结果显示，9例个体携带全部三个变体（c.370_371insACA、c.494T>C和c.1423C>T），其中弱精子症患者1例、NOA患者8例；其余82例未携带这些变体。在所有91例样本中，CRISPR/Cas12a检测结果与Sanger测序完全一致。Sanger测序进一步确认三个变体在同一批个体中共存，支持其作为连锁的USP26变体簇/单倍型存在。

**讨论与结论**

目前尚无临床批准的USP26特异性分子诊断检测。常规PCR和测序方法可能需要较复杂流程、较长周转时间或专门仪器。在本研究实验条件下，CRISPR/Cas12a检测的估算试剂成本（每样本3.75美元）低于qPCR（每样本5.24美元），但该比较未包括人工、设备及其他运行成本，其实用优势仍需进一步评估。临床研究提示，USP26簇变体与生殖表型的关系可能受年龄及遗传或环境因素影响；小鼠研究也表明Usp26缺失相关的生育表型可能依赖年龄和遗传背景。关于KS风险，USP26簇变体是否直接导致KS易感性仍不确定，需要更大规模、更多样化人群的研究。本研究的局限性包括未纳入生育力对照、无独立外部验证队列，且USP26簇变体与基因型-表型的关系仍不完全清楚。总之，本研究将EasyCatch/CRISPR-Cas12a平台应用于此前未探索的遗传靶标USP26簇变体，设计并验证了变体特异性crRNA和RPA引物，引入MluCI和BtsCI限制性内切酶降低WT扩增干扰。在91例男性不育研究样本中，CRISPR/Cas12a检测与Sanger测序完全一致。整个流程可在60分钟内完成，仅需常用实验室设备即可进行荧光判读。该方法可促进USP26变体分子遗传学研究及男性不育相关研究队列的分析。未来仍需纳入生育力对照、更大规模和更多样化人群、盲法检测、独立外部验证及功能学研究，以进一步阐明USP26簇变体的基因型-表型关系及其潜在临床意义。