啤酒糟生物刺激与芽孢杆菌生物强化联合作用对污染土壤中原油生物降解的影响

《BMC Environmental Science》：Combined effects of brewer’s spent grain biostimulation and Bacillus bioaugmentation on crude oil biodegradation in contaminated soil

　　

摘要专业翻译 背景：石油烃污染因其持久性及其对土壤质量和生态系统功能的不利影响，已成为重大环境挑战。本研究评估了啤酒糟（BSG）生物刺激与芽孢杆菌（Bacillus）生物强化联合作用对污染土壤中原油生物降解的影响。 方法：研究采用标准微生物学和理化分析程序，评估了BSG组成、土壤性质、微生物种群以及修复过程中石油烃的降解情况。土壤微宇宙分别添加1%、10%和20%的BSG，并接种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行生物强化。在修复期间监测异养细菌丰度（HBA）、石油降解菌（ODB）、亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）和硝化杆菌（Nitrobacter）种群数量，并在实验结束时测定残留石油烃含量。实验数据经方差分析（ANOVA）以确定处理间的差异。 结果：BSG的组成包括有机碳76.0±0.84%、蛋白质27.5±0.36%、氮2.33±0.05%，热值为399.4±0.35 kcal，表明其作为营养丰富的添加物适用于刺激微生物活性。供试土壤呈酸性，pH为5.05±0.18，总石油烃含量为7.15±0.25 mg/kg，多环芳烃含量为0.57±0.21 mg/kg。异养细菌丰度为7.30±0.32 log?? CFU/g，烃降解菌丰度为2.60±0.61 log?? CFU/g，包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）和微球菌属（Micrococcus）等属，表明存在具有内在生物降解潜力的微生物。对照组1和对照组2中的HBA和ODB种群与添加改良剂和处理土壤中的种群存在显著差异（ANOVA，p<0.05），表明营养补充和生物强化后微生物增殖得到增强。添加1%、10%和20% BSG的生物刺激改善了土壤理化条件，与未处理对照组相比，pH值范围为7.26±0.03至8.21±0.03，氧化还原电位为54.0±0.2至90.0±0.1 mV，含水量为14.97±0.06%至16.52±0.43%。联合处理刺激了微生物增殖，其中10% BSG处理的HBA最高，达8.82±0.88 log?? CFU/g，而石油降解菌在修复过程中得到富集。单独使用枯草芽孢杆菌生物强化实现了49.93%的烃降解率，而生物强化与BSG生物刺激联合处理在1%、10%和20% BSG处理中分别将降解效率提高至88.58%、76.85%和68.61%。低分子量和中分子量烃类（C10–C22）的优先降解以及姥鲛烷（pristane）和植烷（phytane）等生物降解指示化合物的大量减少表明微生物活性增强。 结论：尽管10% BSG支持了异养细菌丰度，但1% BSG处理实现了最高的烃降解效率，表明通过BSG添加进行适度营养补充而非过量有机负荷有利于有效生物降解。这些发现表明，营养驱动的微生物刺激、功能性烃降解菌与优化营养改良策略之间的协同作用提高了生物修复效率，并支持农业工业废弃物作为有效生物刺激剂在环境修复中的可持续利用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

石油烃污染是当前全球面临的重要环境挑战之一。石油勘探和生产活动通过意外泄漏、设备故障或不当废物管理等方式，频繁向陆地和淡水生态系统释放烃类废弃物，造成长期生态损害。石油烃因其化学稳定性、毒性和持久性，能够在土壤和沉积物中积累，破坏生态过程、微生物平衡和生态系统功能。在尼日利亚，石油工业虽是国家经济发展的重要支柱，但数十年的石油开采活动已导致广泛的环境退化，尤其是尼日尔三角洲地区。据报道，该地区每年平均泄漏约24万桶原油，对农业生产力、生物多样性、水质和生态系统服务产生不利影响。

石油烃在污染环境中的自然衰减主要依赖微生物代谢。土著微生物能够以烃类为碳源和能源，促进污染环境的逐步解毒。然而，这一过程的效率常受环境因素制约，包括营养限制、疏水性烃类生物可利用性低、氧气可用性不足以及某些石油馏分的结构复杂性。不完全降解会导致比母体化合物毒性更强或环境持久性更高的中间代谢物积累。因此，需要干预策略来增强微生物降解过程。

生物修复作为一种可持续的修复方法受到广泛关注，它利用微生物的天然代谢能力将有害污染物转化为二氧化碳、水等环境良性产物。与理化修复方法相比，生物修复具有成本低、对生态系统干扰小、可实现污染物完全矿化等优势。生物刺激和生物强化是两种主要的工程化生物修复策略：生物刺激通过营养补充增强土著微生物活性，生物强化则通过引入专门降解菌来增强降解能力。

污染土壤中有效生物降解的主要限制因素之一是营养失衡，特别是支持微生物生长所需的氮和磷不足。有机改良剂因其能同时提供营养、改善土壤结构、增加微生物生物量和增强污染物生物可利用性而特别具有吸引力。啤酒糟（BSG）作为酿造工业大量产生的农业工业副产品，富含有机碳、蛋白质、纤维和必需营养元素，是作为微生物生物刺激剂的理想候选材料。

然而，关于啤酒糟作为生物刺激剂与专门烃降解菌作为生物强化剂联合应用的信息仍然有限。此外，相对较少的研究考察了不同啤酒糟添加率如何影响微生物种群动态、土壤理化特性和烃降解模式。啤酒糟的组成和营养价值因酿造操作、原材料和地理位置而异，来自尼日利亚啤酒厂在热带环境条件下的啤酒糟性能数据尤为稀缺。因此，有必要填补这些知识空白，开发适用于本地的、经济高效且可持续的石油污染环境生物修复策略。

二、研究目的与设计

研究人员提出假设：啤酒糟与原油降解芽孢杆菌的联合应用将刺激微生物活性，实现比单独使用任一策略更高的烃去除率。具体研究目标包括：（1）确定啤酒糟作为潜在生物刺激剂的化学和近似组成；（2）评估啤酒糟和细菌接种物对原油污染土壤理化性质的影响；（3）评估修复过程中微生物种群的变化；（4）利用总烃含量和气相色谱分析定量石油烃的生物降解；（5）确定联合生物刺激-生物强化方法在热带环境条件下对原油修复的效果。

三、主要关键技术方法

研究人员采用多种标准方法开展研究。啤酒糟采自尼日利亚乌约的Champions Breweries，Bonny Light原油来自尼日尔三角洲地区持牌石油公司，原油降解菌分离自尼日利亚阿夸伊博姆州Eniong河的腐殖质沉积物，表层土壤采自乌约大学主校区农场。土壤微宇宙实验采用完全随机设计（CRD），每处理设三次重复。微生物种群采用平板计数法监测，包括异养细菌、石油降解菌、亚硝化单胞菌和硝化杆菌。石油烃降解采用气相色谱法（GC）定量分析，菌株鉴定采用16S rRNA基因测序技术，数据采用方差分析（ANOVA）和Tukey HSD事后检验进行统计分析。

四、研究结果

啤酒糟的化学组成与生物刺激潜力：啤酒糟含水量4.0±0.17%，灰分3.1±0.20%，纤维2.4±0.20%，蛋白质27.5±0.36%，脂质5.0±0.10%，碳水化合物58.0±0.35%，有机碳76.0±0.84%，pH 5.1±0.1，热值399.4±0.35 kcal。无机营养元素含量较低，包括磷酸盐0.21±0.04 mg/kg、硝酸盐1.36±0.07 mg/kg和硫酸盐1.12±0.12 mg/kg，表明啤酒糟的营养贡献主要来自有机组分而非易得的无机形态。啤酒糟还含有可测量的多环芳烃（PAH）1.09±0.1 mg/kg和总石油烃（TPH）23.25±0.12 mg/kg，但其主要贡献更可能与营养和有机质补充相关。

修复过程中土壤理化性质变化：原油污染使土壤pH从微酸性（5.05±0.18）升至碱性（8.35±0.04），啤酒糟改良将pH调节至近中性至微碱性范围（7.26–8.21），处于FAO/WHO推荐范围（6.0–8.5）内。电导率在各处理中保持较低水平（1.77±0.02–160.0±2.61 μS/cm），远低于非盐渍化阈值（2000 μS/cm）。氧化还原电位从污染土壤中的极低值（20.0±0.5–22.0±0.2 mV）升至改良处理中的较高值（54.0±0.2–90.0±0.1 mV），表明向更氧化条件转变。含水量从未处理土壤的1.32±0.22–1.45±0.45%增至改良处理的14.97±0.06–16.52±0.43%，处于微生物活性最佳范围（5–30%）。有机碳和总氮在啤酒糟改良土壤中普遍增加，钙、钾、镁含量增加表明有机改良剂逐步释放养分。

土壤、生物刺激剂和沉积物的微生物学特性：土壤中异养细菌丰度最高，为7.30±0.32 log?? CFU/g，沉积物为5.43±0.43 log?? CFU/g，啤酒糟为4.43±1.03 log?? CFU/g。烃降解菌在土壤中最丰富（2.60±0.61 log?? CFU/g），其次为沉积物（2.30±0.20 log?? CFU/g），啤酒糟中最低（1.32±1.03 log?? CFU/g）。土壤中检测到亚硝化单胞菌（3.52±0.52 log?? CFU/g）和硝化杆菌（3.23±0.23 log?? CFU/g）。真菌丰度在土壤中（5.11±0.11 log?? CFU/g）高于啤酒糟（3.74±0.57 log?? CFU/g）。

细菌分离株的形态和生化特征：共鉴定出12株细菌，分属假单胞菌属、棒状杆菌属、产碱杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、亚硝化单胞菌属、硝化杆菌属、克雷伯菌属和肠球菌属。这些菌属常见于土壤环境，参与营养循环和烃降解。

腐殖质沉积物细菌的烃降解潜力：从Eniong河腐殖质沉积物中分离的5株烃降解菌（HC1–HC5）在原油培养基上表现出不同的生长能力。HC1在7天和14天均显示最强生长（++++），经16S rRNA基因测序鉴定为枯草芽孢杆菌，与NCBI GenBank中枯草芽孢杆菌菌株NC_000964.3的序列相似性最高（99.38%），序列已提交GenBank，登录号为PZ556056。

生物强化和生物刺激过程中微生物种群动态：在80天修复期间，未处理污染对照（对照1）的异养细菌丰度从6.34±0.63 log?? CFU/g逐渐下降至第50天的4.00±0.94 log?? CFU/g，表明自然衰减不足以维持微生物增殖。接种枯草芽孢杆菌改善了微生物生长。对照1和对照2的HBA和ODB值与改良或处理土壤存在显著差异（p<0.05），表明营养补充和生物强化具有刺激效应。10% BSG处理的HBA最高，达8.82±0.88 log?? CFU/g，石油降解菌在修复过程中得到富集。

石油烃降解效率：单独使用枯草芽孢杆菌生物强化实现49.93%的烃降解率，而联合处理在1%、10%和20% BSG处理中分别将降解效率提高至88.58%、76.85%和68.61%。气相色谱分析显示低分子量和中分子量烃类（C10–C22）被优先降解，姥鲛烷和植烷等生物降解指示化合物大量减少，表明微生物活性增强。

五、讨论与结论

研究结果表明，尽管10% BSG支持了最高的异养细菌丰度，但1% BSG处理实现了最高的烃降解效率，表明通过啤酒糟添加进行适度营养补充而非过量有机负荷更有利于有效生物降解。这一发现提示，过高的有机负荷可能增加氧需求、改变土壤结构或引起微生物竞争，从而不利于降解过程。

联合处理中观察到的降解效率显著高于单独生物强化，表明营养驱动的微生物刺激与功能性烃降解菌之间存在协同效应。啤酒糟提供的有机碳和氮源刺激了微生物生长和代谢活性，碳水化合物部分可作为补充碳源和能源，蛋白质来源的氮可支持微生物生物量形成和酶合成。啤酒糟的纤维有机基质还可能改善土壤结构、保水能力、通气性和微生物附着，为持续烃生物降解创造有利条件。

尽管研究取得了显著成果，但研究人员也指出了若干局限性：未设置非生物对照（灭菌土壤添加原油），非生物损失通过控制环境条件最小化；修复后未分析多环芳烃浓度，因此未对PAH降解作出结论；未进行植物形态生理学测定、毒性测试或更广泛的功能性土壤指标评估，无法推断生态恢复或土壤健康的完全恢复。

这些发现支持农业工业废弃物作为有效生物刺激剂在环境修复中的可持续利用，为石油污染土壤的生物修复提供了具有成本效益和本地适用性的策略。该研究填补了啤酒糟生物刺激与芽孢杆菌生物强化联合应用的知识空白，为优化生物修复策略提供了重要科学依据。