《Animal Microbiome》：Optimized approaches to profile low biomass DNA and RNA virome in the upper respiratory tract of beef cattle
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背景：病毒在牛呼吸道（RT）健康中发挥关键作用，然而，从深鼻咽拭子（DNS）中分析上呼吸道（URT）病毒组（DNA和RNA病毒）仍面临挑战，原因在于其低生物量、缺乏明确有效的富集方法，以及未分类病毒序列比例较高。本研究旨在优化DNS样本保存、核酸提取和生物信息
背景：病毒在牛呼吸道（RT）健康中发挥关键作用，然而，从深鼻咽拭子（DNS）中分析上呼吸道（URT）病毒组（DNA和RNA病毒）仍面临挑战，原因在于其低生物量、缺乏明确有效的富集方法，以及未分类病毒序列比例较高。本研究旨在优化DNS样本保存、核酸提取和生物信息学分析流程，以提高肉牛犊牛URT病毒组的表征能力。
结果：研究人员测试了三种DNS保存方法（RNAlater、脑心浸液（BHI）培养基/甘油-80 °C保存，以及BHI培养基/甘油后加RNAlater）。评估了三种核酸提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit、GeneJET Genomic DNA Purification Kit和mirVana? miRNA Isolation Kit），以比较总核酸产量。使用NucleoSpin Virus Kit分别提取病毒DNA和RNA，该试剂盒针对病毒核酸回收进行了优化。经RNAlater保存并使用NucleoSpin Virus Kit提取的DNS样本，获得了最高的病毒DNA（1.35 ± 0.12 μg）和RNA（1.57 ± 0.09 μg）（平均值 ± 标准误）产量，可用于宏基因组测序。分别使用Kraken2和Kaiju进行宏基因组测序和病毒分类学注释，结果显示Kaiju在病毒分类学注释中实现了最大数量的精确匹配，并为牛URT病毒组的分析提供了高分辨率输出。
结论：优化的核酸提取方法和基于Kaiju的分类策略，增强了低生物量DNS样本中病毒核酸的回收效率和分类学注释能力。研究结果强调了有效的保存条件和提取方法在最大化病毒核酸产量中的重要性，同时证明Kaiju比Kraken2提供了更可靠的病毒分类学注释。这些进展为更准确地评估牛及其他农场动物的URT病毒组提供了方法学框架，有助于深入探究病毒在呼吸道健康中的作用。
论文解读
一、研究背景与意义
牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease, BRD）是肉牛养殖业中造成重大经济损失的疾病之一。既往研究已充分表明，呼吸道（Respiratory Tract, RT）微生物组在牛群健康中发挥重要作用，通过提供定植抵抗和影响宿主对呼吸道感染的易感性来调节宿主健康。上呼吸道（Upper Respiratory Tract, URT）微生物组更是下呼吸道（Lower Respiratory Tract, LRT）微生物的重要储库，微生物群落通过吸入和吞咽从URT向LRT转移，可塑造微生物稳态并影响呼吸道健康或疾病进展。
然而，与已得到充分研究的牛URT细菌群落相比，关于病毒组（virome，即微生物群落中病毒的总基因组，包括感染宿主的真核病毒和感染细菌的噬菌体）的研究仍然十分有限。病毒在调节微生物群落结构、微生物间竞争以及呼吸道免疫应答中可能发挥关键作用。噬菌体可调节细菌种群的组成和功能，而靶向宿主的病毒，尤其是RNA病毒，可能作为原发性病原体或免疫调节因子，触发继发性细菌感染并加剧疾病进展。
牛病毒组研究面临多重挑战，包括样本类型、样本保存方法、核酸富集技术，以及宏基因组测序对高质量核酸的高度依赖。深鼻咽拭子（Deep Nasopharyngeal Swabs, DNS）因其非侵入性和可纵向采样微生物群落的能力而被广泛用于URT微生物组研究，但其低微生物生物量和高的宿主背景对病毒富集和核酸回收构成巨大挑战。此外，RNA病毒在样本处理、运输和储存过程中特别容易受到酶促降解的影响，可能导致RNA病毒的低估或检测偏倚。这一空白不仅限制了对牛呼吸道病毒多样性的全面理解，也阻碍了病毒-细菌互作及其在疾病动态中作用的研究。
在生物信息学层面，不同分类工具表现出不同的敏感性和特异性，病毒分类学的全面理解不仅依赖于数据处理软件，还取决于所整合数据库的完整性。目前尚无明确定义的动物共生病毒组分析流程。因此，本研究旨在通过比较DNS样本保存方法、DNA和RNA核酸提取方案以及病毒组分类分析流程，优化从低生物量DNS样本中回收病毒核酸的方法，并提高URT病毒组分类的准确性。
二、主要技术方法
研究人员从加拿大阿尔伯塔省南部一个商业肉牛育肥场（一次性容量约25,000头）招募了24头冬季替补母牛犊（到达时体重334.8 ± 18.1 kg/头），在到达后20天内开展实验，共采集48份DNS样本（每头牛2份拭子），其中1头牛的样本因核酸提取量不足被排除。样本采集后置于冰上2小时内运抵实验室并冻存于-80 °C。研究比较了三种保存条件（RNAlater、BHI培养基/甘油-80 °C、BHI培养基/甘油后加RNAlater），评估了三种总核酸提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit、GeneJET Genomic DNA Purification Kit和mirVana? miRNA Isolation Kit），并使用NucleoSpin Virus Kit经0.45 μm过滤和病毒颗粒富集后分别提取病毒DNA和RNA。病毒RNA经逆转录为cDNA，DNA和cDNA经全基因组扩增（WGA）后构建文库，在Illumina NovaSeq平台进行双端（2 × 100 bp）测序。生物信息学分析中，使用Trimmomatic进行质控和接头修剪，Bowtie2比对去除宿主（牛参考基因组UMD3.1）序列，MEGAHIT进行de novo组装，并分别使用Kraken2（2024 RefSeq病毒数据库）和Kaiju（2023 NR蛋白数据库）进行病毒分类学注释。
三、研究结果
DNS样本保存方法和低生物量DNS样本核酸提取的优化
在总DNA提取方面，BHI培养基/甘油-80 °C保存并使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒提取的新DNS样本获得了更高的总DNA产量（3.75 ± 0.12 μg），显著高于RNAlater保存组（1.98 ± 0.09 μg；P = 0.012）和BHI/甘油+RNAlater组（1.83 ± 0.11 μg；P = 0.007）。QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit在多个DNS样本中未能检测到DNA，产量低于Qubit检测限。在总RNA提取方面，RNAlater保存并使用mirVana? miRNA分离试剂盒提取的新DNS样本获得了更高的RNA产量（3.98 ± 0.23 μg），显著高于BHI/甘油组（1.00 ± 0.08 μg；P < 0.001）和BHI/甘油+RNAlater组（1.25 ± 0.11 μg；P < 0.001）。
使用NucleoSpin Virus Kit提取病毒核酸时，新采集DNS样本中病毒DNA产量在各保存条件间无显著差异，但病毒RNA产量在RNAlater组（1.57 ± 0.09 μg）显著高于BHI/甘油组（0.89 ± 0.06 μg；P = 0.005）和BHI/甘油+RNAlater组（1.02 ± 0.04 μg；P = 0.016）。此外，新样本的总RNA产量（3.98 ± 0.23 μg）有高于冻存一年样本（3.20 ± 0.30 μg）的趋势（P = 0.074），新样本的病毒DNA（1.35 ± 0.12 μg）和病毒RNA（1.57 ± 0.09 μg）均显著高于冻存样本（病毒DNA：0.91 ± 0.07 μg，P = 0.026；病毒RNA：0.89 ± 0.06 μg，P = 0.003）。
BHI培养基/甘油传统上用于活菌冷冻保存，甘油作为冷冻保护剂减轻冻融引起的细胞裂解，配合依赖机械裂解和硅胶膜结合的GeneJET试剂盒，对保持完整微生物细胞和促进总DNA提取特别有效。然而，由于缺乏RNA稳定剂，BHI/甘油对酶促RNA降解无保护作用，导致总RNA和病毒RNA回收效果差。相比之下，RNAlater能快速渗透细胞/组织并不可逆地灭活RNase，被广泛用于稳定和保存野外采集样本中易降解的RNA，同时已被证明能保持有囊膜和无囊膜病毒的感染性。BHI/甘油与RNAlater的组合未产生叠加效应，反而在所有提取方法中产量最低，这可能反映了两种缓冲液目的相悖（BHI/甘油维持微生物活性，RNAlater作为固定剂）及其理化性质差异，如离子强度或粘度改变，可能破坏细胞完整性或干扰核酸纯化。
生物信息学分析流程优化以分析牛URT病毒组
经质量控制并去除宿主读段后，每个样本平均保留19,595,099 ± 772,532条读段。Kraken2注释了23,931条病毒重叠群（contig），Kaiju注释了42,977条。去除单例后，Kraken2数据集保留23,748条，Kaiju数据集保留42,871条。在分类学水平上，Kraken2将病毒重叠群分配到6个界、13个门、18个纲、20个目、36个科、122个属和191个种；Kaiju分配到6个界、7个门、8个纲、27个目、37个科、88个属和182个种。
在物种水平，Kraken2鉴定出羊传染性脓疱病毒（Orf virus，41.04%）和β冠状病毒1（Betacoronavirus 1，17.63%）为最丰富物种，其次是牛鼻炎B病毒（BRBV，10.88%）、D型流感病毒（IDV，4.75%）和牛鼻炎A病毒（BRAV，1.64%）。Kaiju同样鉴定出Orf virus（50.88%）为优势物种，但额外检测到BRBV（13.71%）、BRAV（8.64%）、IDV（3.39%）、牛冠状病毒（BCoV，3.02%）、Betacoronavirus 1（7.24%）、牛鼻病毒1（BRV1，1.64%）、有蹄类细小病毒6（1.64%）和牛α疱疹病毒1（1.58%），其中许多在Kraken2结果中缺失或低于检测限。
按基因组类型分类，Kraken2鉴定出131种dsDNA病毒、9种ssDNA病毒、37种ssRNA病毒和14种未分类病毒，未检测到dsRNA病毒；Kaiju检测到95种dsDNA病毒、9种ssDNA病毒、1种dsRNA病毒、70种ssRNA病毒和7种未分类病毒。共同检测到的物种主要由dsDNA和ssRNA病毒组成，Orf virus是dsDNA的主要代表，Betacoronavirus 1和牛鼻炎病毒在ssRNA部分贡献显著。Kraken2特异检测的物种主要富集于dsDNA噬菌体，包括曼海姆菌（Mannheimia）和链球菌（Streptococcus）噬菌体；Kaiju特异检测的物种则包括更广泛的宿主相关ssRNA和ssDNA病毒，如牛正肺病毒、牛病毒性腹泻病毒2（BVDV-2）和有蹄类细小病毒。
四、讨论与结论
Kraken2与Kaiju之间观察到的病毒分类差异可能反映了它们在算法和参考数据库方面的根本区别。Kraken2采用基于k-mer的快速精确匹配策略，针对RefSeq病毒数据库，能高效分类具有高核苷酸保守性的已知病毒序列，但分类准确性高度依赖数据库完整性，对分歧或片段化病毒序列的敏感性有限。Kaiju则采用蛋白水平比对，针对更广泛且分类学更多样化的NCBI NR数据库，涵盖环境、未培养和进化上分歧的病毒类群，其对同义替换和移码突变的耐受性提高了检测低核苷酸同一性病毒同源物的能力。这可能是Kaiju检测到更多牛呼吸道相关病毒（尤其是RNA病毒）的原因，包括牛正肺病毒、BRV1、牛逆转录病毒CH15和BVDV-2，这些均为BRD复合体的已知贡献因子，而Kraken2未检测到这些病毒。但Kraken2检测到了对调节URT微生物群至关重要的噬菌体，因此将两种工具结合使用可能获得更完整的病毒组表征。
本研究显著提高了RNA病毒的回收率，并扩展了同时表征DNS样本中DNA和RNA病毒的能力。研究中鉴定出的RNA病毒如BCoV、IDV、BRV1和BVDV-2均为引起BRD的已知病毒。研究结论指出，使用RNAlater进行样本保存和NucleoSpin Virus Kit进行核酸提取，为宏基因组文库制备提供了高质量材料。Kaiju检测到更广泛的病毒类群，尤其是RNA病毒，这可能反映了其蛋白水平比对策略和数据库组成；而Kraken2通过k-mer分类提供了噬菌体的互补检测。这些差异强调了方法学上的互补性，而非某一分类器固有的生物学优越性。该优化工作流程有助于全面且具有生物学信息量的URT病毒组分析，同时承认数据库组成和分类策略对分类学输出的影响。但本研究未评估不同拭子类型对病毒组组成的影响，这是未来标准化的重要考虑因素。
