过硼酸钠四水合物调节神经炎症并降低星形胶质细胞中婴儿利什曼原虫感染

《Parasitology》：Sodium perborate tetrahydrate modulates neuroinflammation and reduces Leishmania infantum infection in astrocytes

　　

利什曼病是一种由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的被忽视的热带疾病。尽管寄生虫通常被认为是巨噬细胞驻留病原体，但越来越多的证据表明，利什曼原虫（Leishmania）能够穿越血脑屏障并诱发神经系统表现，即所谓的脑利什曼病。星形胶质细胞（astrocytes）作为中枢神经系统免疫稳态的关键调节者，在利什曼原虫（Leishmania）感染背景下的特征仍鲜有研究。在本研究中，研究人员探讨了过硼酸钠四水合物（sodium perborate tetrahydrate, SPT）在婴儿利什曼原虫（L. infantum）感染的小鼠星形胶质细胞中的基于神经免疫的抗利什曼原虫效应。SPT浓度在25至150 μM之间时，星形胶质细胞活力在24–72小时内维持在90%以上。流式细胞术（flow cytometry）分析表明，未处理组在24小时时的星形胶质细胞感染率约为23%，而SPT处理后显著降低。在72小时时，SPT处理组的感染率约为4–7%。SPT通过将活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平降低至未处理感染细胞的17–29%相对荧光强度，显著降低了细胞内氧化应激，同时增加了细胞内谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平。基因表达分析显示炎症介质受到调节，包括在100 μM时IL-12B上调、在200 μM时TNF-α上调，同时IL-10下调，表明向促炎性宿主保护性反应转变。综上所述，这些发现提供了体外证据，表明SPT可降低L. infantum感染并调节C8-S星形胶质细胞中的氧化还原和炎症反应。据研究人员所知，这是首次在L. infantum感染的星形胶质细胞体外模型中研究SPT的抗利什曼原虫和免疫调节效应的研究。

论文解读：过硼酸钠四水合物在婴儿利什曼原虫感染星形胶质细胞中的抗寄生虫与免疫调节作用

一、研究背景与科学问题

利什曼病是由利什曼原虫属原生动物寄生虫引起的一类被忽视的热带疾病，全球范围内仍构成重大公共卫生挑战。尽管该病主要累及皮肤、黏膜或内脏器官，但已有临床和实验证据表明，寄生虫、寄生虫衍生物质、抗利什曼原虫抗体及炎症改变可出现在中枢神经系统相关 compartments，提示脑利什曼病的生物学相关性。然而，中枢神经系统受累的机制尚未完全阐明。星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量丰富的胶质细胞，在组织稳态、氧化还原调节、吞噬活性及细胞因子产生中发挥重要作用，并在感染、损伤或神经退行性刺激下可呈现反应性表型，表达IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症介质。尽管巨噬细胞被视为利什曼原虫的经典宿主细胞，胶质细胞在寄生虫相关神经炎症及局部宿主反应中的潜在贡献受到的关注有限。

当前利什曼病的治疗主要依赖数量有限的化疗药物，包括五价锑剂、喷他脒、两性霉素B及其脂质制剂、米替福新和巴龙霉素。这些药物虽为临床管理的基石，但其疗效日益受到严重局限性的制约，包括治疗窗窄导致的显著全身毒性、需要长期或静脉给药以及耐药菌株的不断出现。因此，迫切需要开发更有效、更安全且能克服耐药机制的新型治疗策略，宿主导向或免疫调节策略已成为抗利什曼原虫治疗中有前景的方向。硼基化合物因其抗菌、氧化还原调节和免疫调节特性而受到越来越多的关注。过硼酸钠四水合物此前已被研究团队证实对婴儿利什曼原虫前鞭毛体具有抗寄生虫活性，并能在感染的巨噬细胞中调节炎症基因表达，但其在中枢神经系统相关宿主细胞中的效应此前从未被研究。

二、研究目的

本研究旨在评估SPT能否在保留星形胶质细胞活力的前提下，降低婴儿利什曼原虫相关的星形胶质细胞感染率并调节炎症基因表达。据研究人员所知，这是首次在婴儿利什曼原虫感染的星形胶质细胞中研究SPT的抗利什曼原虫和免疫调节效应，通过整合双荧光流式细胞术、活性氧、谷胱甘肽及炎症基因表达分析，探讨SPT作为寄生虫感染和星形胶质细胞相关神经炎症反应潜在调节剂的作用。

三、主要关键技术方法

研究人员采用小鼠星形胶质细胞系C8-S作为宿主细胞模型，婴儿利什曼原虫前鞭毛体（MHOM/MA/67/ITMAP-263）用于感染实验。关键技术方法包括：采用MTS法评估SPT对星形胶质细胞的细胞毒性；采用研究团队此前建立并验证的双荧光流式细胞术（PKH26标记星形胶质细胞、PKH67标记寄生虫）定量感染率；采用DCFDA荧光探针结合流式细胞术检测细胞内活性氧水平；采用DTNB比色法测定谷胱甘肽水平；采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测炎症、免疫、氧化应激及组织重塑相关基因的表达水平。

四、研究结果

SPT在星形胶质细胞中的细胞毒性测定： 在25至150 μM浓度范围内，SPT处理24、48和72小时后，未感染C8-S星形胶质细胞活力维持在约90%以上，其中100 μM SPT处理72小时后细胞活力约为100%，表明所测浓度未对未感染星形胶质细胞产生显著细胞毒性。

流式细胞术测定SPT对婴儿利什曼原虫感染星形胶质细胞的抗利什曼原虫效应： 感染前验证了双荧光标记效率，91.78%的前鞭毛体成功标记PKH67，99.67%的星形胶质细胞标记PKH26。在24小时时，未处理感染组平均感染率约为23%，75、100、150、200和400 μM SPT处理后感染率分别显著降至20.00%、17.00%、11.89%、7.97%和12.63%，其中200 μM SPT效果最为显著。在48小时时，未处理组感染率降至2.91%，各SPT处理组维持在约3%。在72小时时，未处理组感染率约为13%，75 μM SPT处理后显著降至3.75%，100至400 μM SPT处理后约为7%。结果表明浓度≥75 μM的SPT对利什曼原虫感染的星形胶质细胞具有显著抗寄生虫效应。

感染星形胶质细胞的形态学分析： 相差显微镜观察显示，SPT处理后感染星形胶质细胞数量减少，细胞表面形态和附着发生显著变化，星形胶质细胞特有的星状结构转变为圆形、球形特征，细胞间因形态改变而分离。

SPT处理的感染星形胶质细胞荧光显微镜分析： 荧光显微镜下，未处理的寄生虫暴露培养物显示PKH26阳性星形胶质细胞、PKH67阳性前鞭毛体相关信号及红绿荧光重叠区域。SPT处理后，PKH67相关绿色荧光信号的频率和强度在48小时时低于24小时，定性支持了流式细胞术发现的SPT处理后寄生虫相关荧光减少的结果。

SPT处理后感染星形胶质细胞中活性氧的测定： 除100 μM外，所有测试SPT浓度在24小时时均显著降低星形胶质细胞内活性氧水平。50、75、150和200 μM SPT处理后，活性氧水平分别显著降低至约28.24%、21.83%、29.22%和17.85%，所有处理组活性氧水平均降至阴性对照的30%以下。阳性对照叔丁基过氧化氢处理后活性氧水平显著升高至约84%。

SPT处理的感染星形胶质细胞中谷胱甘肽水平的氧化应激评估： 50、100、150和200 μM SPT处理显著增加了感染星形胶质细胞中的谷胱甘肽水平，降低了氧化应激，而75 μM SPT未引起谷胱甘肽水平的显著增加。

SPT处理后感染星形胶质细胞的基因表达水平： qPCR分析显示，100 μM SPT显著上调IFN-γ基因表达（1.33倍）；200 μM SPT显著上调TNF-α基因表达（1.34倍），而50、75、100和150 μM SPT则显著降低TNF-α表达；100 μM和150 μM SPT分别显著上调IL-12B表达3.45倍和3.08倍，而50、75和200 μM SPT则显著降低其表达；NF-κB基因表达在各处理组间无显著差异；仅150 μM SPT显著上调IL-1β表达3.81倍；50、100、150和200 μM SPT显著下调IL-10基因表达；STAT1基因表达在SPT处理后有所增加但未达显著水平；iNOS、MMP2和TGF-β1基因表达在SPT处理后未发生显著变化。

五、讨论与结论

讨论部分指出，SPT在保留未感染星形胶质细胞活力的同时显著降低了流式细胞术测定的婴儿利什曼原虫感染率，且其效应并非严格浓度依赖性，在中间浓度范围内可能已达到最大有效反应。活性氧水平与感染率的同时降低提示SPT的抗寄生虫活性可能并非主要依赖活性氧介导的寄生虫杀伤，而可能通过直接作用于寄生虫并同时恢复感染星形胶质细胞的氧化还原稳态来实现。谷胱甘肽水平的升高进一步支持SPT的氧化还原调节作用。基因表达分析显示SPT同时调节促炎和抗炎介质，IL-12B和TNF-α的上调以及IL-10的下调提示向促炎性宿主保护性反应的转变，而IL-1β仅在150 μM时上调，STAT1、iNOS和MMP2无显著变化，可能与SPT介导的炎症和抗炎双重作用有关。研究仅局限于转录水平分析，后续需在蛋白水平验证相关介质的变化。

结论部分：本研究证明SPT在细胞毒性测试浓度范围内显著降低了流式细胞术测定的星形胶质细胞中婴儿利什曼原虫感染率，同时保留了未感染C8-S细胞的活力。SPT处理还与细胞内活性氧水平降低、谷胱甘肽水平升高及炎症基因表达调节相关，提示其具有联合的抗利什曼原虫、氧化还原调节和免疫调节效应。据研究人员所知，这是首次在婴儿利什曼原虫感染的星形胶质细胞中证明SPT的抗利什曼原虫活性及其对星形胶质细胞相关炎症和氧化还原反应的调节作用。SPT在体外利什曼原虫感染模型中基于神经炎症的抗利什曼原虫疗效，凸显了抗利什曼原虫治疗在未来体内研究和临床研究中的潜力。