《Virulence》：The long noncoding RNA MAPKAPK5-AS1 promotes the formation of hepatitis B virus cccDNA by modulating the expression of NABP1
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摘要专业翻译
细胞长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）已被证明参与多种生物学通路，包括对病毒感染的调控。然而，它们在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）生命周期中的功能仍有待探索。研究人员开展了一项针
摘要专业翻译
细胞长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）已被证明参与多种生物学通路，包括对病毒感染的调控。然而，它们在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）生命周期中的功能仍有待探索。研究人员开展了一项针对1779个人类lncRNAs的功能缺失筛选，鉴定出19个与HBV感染相关的lncRNAs。其中，一个名为MAPKAPK5-AS1（lnc-MAAS）的lncRNA被鉴定为HBV感染所需的宿主因子。研究数据表明，lnc-MAAS参与HBV松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）向共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的转化过程。进一步的机制实验揭示，lnc-MAAS通过调控核酸结合蛋白1（nucleic acid binding protein 1，NABP1）的表达来影响cccDNA的形成。综上，该研究阐明了宿主lnc-MAAS和NABP1在HBV cccDNA形成中的作用，这可能有助于开发新型抗HBV治疗策略。
论文解读
一、研究背景与研究目的
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种小型包膜嗜肝DNA病毒，全球约有2.54亿人慢性感染。HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的持续存在是慢性HBV感染的根源，也是进展性肝病（包括肝硬化和肝细胞癌）的高危因素。HBV cccDNA位于感染肝细胞核内，是所有病毒转录的模板。目前批准的抗HBV药物（包括I型干扰素和核苷（酸）类似物）无法消除cccDNA，因此亟需深入理解HBV在人类肝细胞中的生命周期以寻找治愈HBV的新靶点。
HBV基因组约3.2 kb，仅编码7种病毒蛋白，因此人类肝细胞中的多种宿主因子对HBV成功感染不可或缺。以往对HBV-宿主相互作用的研究主要集中在宿主蛋白编码基因的功能上，但近年研究表明细胞长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）在HBV复制中也发挥重要作用。例如，lncRNA DLEU2可通过直接结合HBV X蛋白维持cccDNA转录从而增强HBV复制；lncRNA HOTTIP和LINC01431则作为HBV转录的宿主限制因子。然而，HBV与宿主lncRNAs之间的相互作用仍 largely 未被探索。为此，研究人员开展了针对1779个人类lncRNAs的功能缺失筛选，以鉴定参与HBV生命周期的新型宿主lncRNAs。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用靶向1779个人类lncRNAs的内切核糖核酸酶制备的小干扰RNA（endoribonuclease-prepared small interfering RNA，esiRNA）文库，在HepG2-hNTCP细胞模型中进行了HBV感染的功能缺失筛选，鉴定出19个与HBV感染相关的lncRNAs。其中，MAPKAPK5-AS1（lnc-MAAS）被选为进一步功能表征的候选分子。研究证实lnc-MAAS是HBV感染所需的宿主因子，参与HBV rcDNA向cccDNA的转化过程。机制研究表明，lnc-MAAS通过转录水平调控核酸结合蛋白1（nucleic acid binding protein 1，NABP1）的表达来影响cccDNA形成。该研究首次建立了lnc-MAAS/NABP1调控轴在HBV cccDNA形成中的功能联系，为开发新型抗HBV治疗策略提供了机制框架和潜在靶点。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：esiRNA文库筛选（针对1779个人类lncRNAs的功能缺失筛选，以HBeAg水平为读出指标）；HBV感染模型（使用HepG2-hNTCP细胞系和原代人肝细胞，HBV病毒株包括基因型A、B、C、D）；cccDNA定量检测（T5核酸外切酶处理结合qPCR以及Southern blot）；HBV附着和内化实验；RNA测序（NovaSeq 6000平台，双端150 bp读长）；慢病毒介导的基因敲除（CRISPR/Cas9技术建立NABP1敲除细胞系）；启动子荧光素酶报告基因实验；放线菌素D处理评估mRNA稳定性。
四、研究结果
1. 鉴定与HBV感染相关的宿主lncRNAs
研究人员在HepG2-hNTCP细胞模型中开展了针对1779个人类lncRNAs的esiRNA功能缺失筛选。以靶向HBV功能性受体牛磺胆酸钠共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）的esiRNA验证了检测体系的可靠性。根据Z分数≤?2或≥2的标准，排除毒性esiRNA和非表达lncRNAs后，共鉴定出19个与HBV感染相关的lncRNAs。其中，13个lncRNAs的缺失降低分泌型HBeAg水平，表明它们是HBV感染所需的正调控因子；另外6个lncRNAs的敲低显著增加HBeAg水平，为负调控因子。cccDNA检测显示，13个正调控lncRNAs的敲低大多降低cccDNA水平，而6个负调控lncRNAs对cccDNA水平无显著影响，提示它们作用于HBV生命周期的转录或转录后阶段。
2. lnc-MAAS的特征分析
lnc-MAAS基因位于12号染色体反向链上，具有多个异构体。编码潜能计算器（Coding Potential Calculator，CPC）分析显示所有lnc-MAAS异构体的CPC分数与已验证的lncRNA NEAT1相似，远低于蛋白编码基因GAPDH，表明lnc-MAAS缺乏编码潜能。亚细胞定位分析显示lnc-MAAS同时分布于细胞质和细胞核。lnc-MAAS在稳定表达HBV的细胞系（HepG2.2.15和HepAD38）以及HBV感染的HepG2-hNTCP细胞中均显著上调。
3. lnc-MAAS是HBV感染所必需的
在HepG2-hNTCP细胞中敲低lnc-MAAS可显著降低分泌型HBeAg和HBsAg水平约70%，HBcAg染色结果与ELISA数据一致。cccDNA定量（qPCR和Southern blot）显示lnc-MAAS敲低可降低cccDNA水平约60%。该效应在HBV基因型A、B、C、D中均观察到，表明lnc-MAAS发挥泛基因型的促病毒功能。CCK-8和Annexin V/PI实验排除了细胞毒性效应。lnc-MAAS过表达可适度但显著地增加HBV感染约30%。在原代人肝细胞中，lnc-MAAS沉默同样导致HBeAg分泌、HBcAg表达和cccDNA水平显著降低。
4. lnc-MAAS参与HBV cccDNA形成
通过HBV附着和内化实验，研究人员发现lnc-MAAS敲低不影响病毒附着和内化，也不影响核内蛋白游离rcDNA（protein-free rcDNA，PF-rcDNA）水平。利用恩替卡韦（entecavir，ETV）抑制新rcDNA形成和cccDNA补充后，lnc-MAAS敲低对已建立的cccDNA库无显著影响，表明lnc-MAAS不参与cccDNA周转调控，而是参与cccDNA形成过程。
5. lnc-MAAS在cccDNA形成中的功能由NABP1介导
通过RNA测序筛选lnc-MAAS调控的候选基因，结合DNA修复相关功能筛选，研究人员确定NABP1（一种单链DNA结合蛋白）为关键下游分子。NABP1敲低可显著降低感染细胞中cccDNA水平，且两个独立siRNA验证结果一致。在NABP1敲除的HepG2-hNTCP细胞中，lnc-MAAS对cccDNA形成的作用几乎完全消失；在lnc-MAAS敲低细胞中恢复NABP1表达可挽救cccDNA形成。在HepAD38细胞中重复实验获得一致结果。
6. lnc-MAAS转录水平调控NABP1表达
qPCR和免疫印迹分析显示，lnc-MAAS敲低降低NABP1水平，而过表达lnc-MAAS增加NABP1水平。NABP1启动子荧光素酶报告基因实验表明，lnc-MAAS敲低显著降低荧光素酶活性，过表达则增加活性。放线菌素D处理实验显示lnc-MAAS对NABP1 mRNA稳定性无显著影响。因此，lnc-MAAS通过调控NABP1启动子的转录活性来调节NABP1表达。
五、讨论与结论
本研究通过功能缺失筛选鉴定出19个与HBV感染相关的宿主lncRNAs，其中10个影响cccDNA水平，与既往报道的仅调控cccDNA转录而不影响cccDNA水平的lncRNAs（如DLEU2、HOTTIP和LINC01431）不同。lnc-MAAS被证实为HBV的促病毒因子，通过转录水平调控NABP1表达参与cccDNA形成。NABP1（又称人单链DNA结合蛋白2，hSSB2）作为单链DNA结合蛋白家族成员，参与细胞DNA损伤反应以维持基因组稳定性。NABP1敲除小鼠无明显表型缺陷，提示其在体内的生物学功能非必需，因此NABP1可能是治疗HBV感染的潜在靶点。此外，lnc-MAAS还可能参与宿主免疫和代谢相关通路，其在HBV相关免疫调控中的确切作用有待进一步研究。
研究结论：通过功能缺失筛选，研究人员鉴定出lnc-MAAS为HBV感染所需的新型宿主lncRNA。研究数据表明，lnc-MAAS通过调控NABP1表达参与HBV cccDNA形成。虽然即时临床转化仍面临重大挑战，但该研究为未来机制指导的干预策略提供了关键机制框架。所建立的lnc-MAAS/NABP1调控轴代表了宿主导向抗病毒研究的有前景的候选靶点，值得在适当的转化模型中进一步验证。
