G3BP1通过PI3K/AKT通路调控脂肪细胞分化促进小鼠肥胖的作用机制研究

《Adipocyte》：The pro-obesity role of G3BP1 through altering adipogenic differentiation in mice via the PI3K/AKT pathway

　　

： 作为一种日益增长但非传染性的流行病，肥胖是多种合并症的常见病因。GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（G3BP1）是应激颗粒组装的核心调控因子，在代谢性疾病中具有重要影响。本文旨在体外和体内探究G3BP1在肥胖中的功能机制。研究人员采用功能学实验检测细胞表型，运用逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹法检测转移相关、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达，采用油红O染色和苏木精-伊红（H&E）染色评估脂质沉积，运用RT-qPCR、蛋白质印迹法和免疫荧光染色确定脂肪细胞分化和脂质代谢情况，并利用TOPFlash/FOPFlash报告基因实验鉴定β-catenin活性。在高脂饮食（HFD，60%脂肪）喂养的小鼠模型中，研究人员在检测脂肪因子水平前测量体重，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测脂肪因子水平，使用试剂盒检测甘油三酯（TG）浓度，并通过蛋白质印迹法检测脂肪生成标志基因。G3BP1敲低抑制了3T3-L1前脂肪细胞的增殖、迁移、侵袭和脂肪生成，诱导细胞周期阻滞，并降低了肥胖小鼠的体重、脂肪生成和脂肪积累。G3BP1激活了Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路。LY294002（PI3K抑制剂）和SC3036（PI3K激活剂）逆转了G3BP1过表达或G3BP1沉默对前脂肪细胞侵袭的体外效应。G3BP1可能通过促进前脂肪细胞增殖、迁移、侵袭和脂肪生成来促进肥胖的进展，这可能与PI3K/AKT通路相关。

论文解读文章

一、研究背景与意义

肥胖被定义为机体对慢性营养过剩的适应性反应，源于能量储存与消耗之间的失衡。2020年全球超重和肥胖成人患病率已达38%，预计到2035年将接近50%。肥胖可导致血糖异常、血脂异常、胰岛素抵抗等代谢紊乱，并显著增加2型糖尿病、高血压、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病和癌症等多种非传染性疾病的风险。脂肪组织作为以甘油三酯（TG）形式存在的被动能量储存器官，其功能障碍会导致脂质溢出并引发其他器官的异位脂肪沉积，进而造成代谢紊乱。

应激颗粒（SGs）是应激条件下由非翻译mRNA形成的mRNA-蛋白质组装体。GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（G3BP1），又称应激颗粒组装因子1，作为"RNA凝聚器"驱动分子间RNA-RNA相互作用，稳定RNA凝聚体并促进核糖核蛋白颗粒的持续存在。作为一种多功能结合蛋白，G3BP1影响细胞增殖、分化、凋亡和RNA代谢，并介导与神经系统疾病、癌症进展及细菌和病毒感染相关的信号通路。已有研究报道G3BP1在高脂饮食（HFD）喂养小鼠的肝脏和耳蜗组织中过表达，并与肥胖小鼠肝脏脂质沉积的缓解和胰岛素抵抗相关。然而，关于G3BP1在肥胖中重要作用的数据仍然有限。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路对细胞生长、转移、存活等细胞行为至关重要，在脂肪生成中发挥核心作用，是前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化所必需的，其激活可促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）等关键脂肪生成转录因子的表达，从而驱动脂质积累和脂肪细胞成熟。PI3K/AKT通路是正常代谢所必需的，该通路的失衡是肥胖中的常见事件。G3BP1已被认为是癌症中PI3K/AKT通路的激活因子。本研究旨在从体外和体内两方面探究G3BP1在肥胖中的功能机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过数据库分析、体外细胞实验和体内动物实验，系统探究了G3BP1在肥胖发生发展中的作用及机制。研究得出以下主要结论：G3BP1沉默可抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖、迁移、侵袭和脂肪生成，诱导细胞周期阻滞；在HFD诱导的肥胖小鼠中，G3BP1敲低可降低体重、脂肪生成和脂肪积累；G3BP1可激活Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路，且G3BP1对前脂肪细胞侵袭的促进作用依赖于PI3K/AKT通路的激活。该研究为G3BP1作为代谢性疾病新的干预靶点提供了新见解。

三、关键技术方法

研究人员利用Adipose Tissue Knowledge Portal数据库（https://adiposetissue.org/）进行G3BP1在肥胖患者与非肥胖患者中的转录组学和蛋白质组学分析。体外实验采用3T3-L1小鼠前脂肪细胞系，通过小干扰RNA（siRNA）敲低和过表达载体转染实现G3BP1的基因沉默和过表达。体内实验采用6-8周龄无特定病原体雄性C57BL/6小鼠，给予含60 kcal%脂肪的高脂饮食（HFD）喂养，通过尾静脉注射siRNA复合物（5 mg/kg，每5天一次）实现G3BP1的体内敲低。主要技术方法包括：逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因表达、蛋白质印迹法检测蛋白表达、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）成像实验检测细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期、划痕实验检测细胞迁移、Transwell实验检测细胞侵袭、免疫荧光染色、油红O染色、苏木精-伊红（H&E）染色、脂质定量、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及TOPFlash/FOPFlash荧光素酶报告基因实验。

四、研究结果

（一）G3BP1沉默抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖并诱导细胞周期阻滞

通过Adipose Tissue Knowledge Portal数据库分析发现，G3BP1在成熟脂肪细胞中高表达，其表达在脂肪生成过程中逐渐增加。在人类脂肪组织中，G3BP1转录水平与循环C反应蛋白（CRP）和脂肪细胞体积呈正相关，与异丙肾上腺素刺激的脂解作用呈负相关。转染si-G3BP1后，3T3-L1前脂肪细胞中G3BP1表达降低，细胞活力下降，EdU阳性细胞数量减少，增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）蛋白表达下降。流式细胞术显示G0/G1期细胞比例增加，S期和G2/M期细胞比例减少，细胞周期蛋白B1（CCNB1）和细胞周期蛋白D2（CCND2）蛋白表达降低。

（二）G3BP1沉默抑制3T3-L1前脂肪细胞迁移和侵袭

G3BP1沉默后，3T3-L1前脂肪细胞的划痕愈合率降低，Transwell实验中侵袭细胞数量减少，基质金属蛋白酶9（MMP9）、基质金属蛋白酶7（MMP7）和基质金属蛋白酶2（MMP2）的mRNA和蛋白表达均下降。

（三）G3BP1正向调控脂肪生成

油红O染色显示，G3BP1沉默抑制脂滴形成，而G3BP1过表达促进脂滴形成。G3BP1下调降低了PPARγ、C/EBPα、脂联素受体1（ADIPOR1）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、瘦素受体（LEPR）、脂肪酸合酶（FAS）、脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO）等脂肪生成和脂肪代谢相关基因的表达。免疫荧光染色证实G3BP1沉默的脂肪细胞中FABP4和PPARγ荧光强度减弱。

（四）G3BP1缺失阻断Wnt/β-catenin通路

TOPFlash/FOPFlash报告基因实验显示，G3BP1敲低后β-catenin活性降低，而G3BP1过表达后β-catenin活性升高。G3BP1沉默抑制了β-catenin、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、c-Myc和轴抑制蛋白2（Axin2）的mRNA和蛋白表达。

（五）G3BP1通过PI3K/AKT通路促进3T3-L1前脂肪细胞侵袭

G3BP1过表达增加了p-PI3K和p-AKT蛋白表达，而LY294002（PI3K抑制剂）可逆转这一效应。SC3036（PI3K激活剂）可增加G3BP1沉默的3T3-L1前脂肪细胞中p-PI3K和p-AKT的蛋白表达。G3BP1过表达促进前脂肪细胞侵袭，G3BP1干扰抑制侵袭，LY294002或SC3036可分别中和这些效应。

（六）G3BP1敲低缓解HFD喂养肥胖小鼠的脂肪生成和脂肪代谢紊乱

注射si-G3BP1后，附睾白色脂肪组织（eWAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中G3BP1表达显著降低。G3BP1缺陷显著降低了肥胖小鼠的体重增长，而食物摄入量无显著差异。ELISA结果显示，G3BP1下调后皮下脂肪组织和肝脏样本中抵抗素浓度降低、脂联素水平升高，血清抵抗素浓度及eWAT和iWAT中抵抗素表达也降低。G3BP1干扰降低了肥胖小鼠皮下脂肪组织和肝脏样本中的TG含量。油红O染色和H&E染色显示G3BP1下调抑制了eWAT和iWAT中的脂肪积累。在G3BP1沉默的肥胖小鼠皮下脂肪组织和肝脏样本中，C/EBPα、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）和长链脂酰辅酶A合成酶家族成员1（ACSL1）蛋白表达降低。体内实验中，G3BP1沉默后eWAT和iWAT中p-AKT和PPARγ（PI3K/AKT信号的下游靶标）表达均下调。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的新颖性在于：除脂肪生成外，研究还证明了G3BP1沉默抑制前脂肪细胞增殖、迁移和侵袭；提供了G3BP1下调缓解HFD诱导的体重增加、脂质沉积和代谢异常的体内证据；确定了Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号作为下游机制，并揭示了G3BP1在VAT与SAT中的组织特异性表达。研究结果与Liu等人的报道存在差异，这可能归因于实验模型和靶组织的差异：本研究采用急性全身性siRNA敲低模型，而Liu等人使用通过繁殖产生的杂合G3BP1小鼠（慢性遗传模型）；Liu等人主要关注肝脏，而本研究聚焦于脂肪组织和脂肪生成。Adipose Tissue Knowledge Portal数据库显示肥胖与非肥胖个体之间存在高度异质性，G3BP1 mRNA在VAT中低于SAT而蛋白表达呈相反模式，表明存在组织特异性的转录后或翻译调控。这些观察提示G3BP1的功能具有背景依赖性。

研究结论为：G3BP1可能在体外加重脂质积累和脂肪代谢紊乱，并在体内发挥促肥胖作用。此外，G3BP1对前脂肪细胞侵袭的影响可能是PI3K/AKT通路激活的结果，这可能为G3BP1作为代谢性疾病新的干预靶点的进一步研究提供新见解。