一株源自白酒酒糟的产阿魏酸酯酶新菌株Bacillus altitudinis ZH-1及其在测定条件下无β-木糖苷酶活性的酶鸡尾酒用于阿拉伯木聚糖类底物生产功能糖

《Foods》：A Novel Feruloyl Esterase-Producing Strain ZH-1 Belonging to Bacillus altitudinis from Baijiu Distiller’s Grains and Its Enzyme Cocktail with No Detectable β-Xylosidase Activity for Producing Functional Sugars from Arabinoxylan-Type Substrates

　　

阿拉伯木聚糖丰富的农业残留物是生产高价值功能糖和阿魏酸的有前景原料，但其复杂交联结构阻碍了高效酶转化。本研究旨在从白酒酒糟中分离一株新型产阿魏酸酯酶（feruloyl esterase, FAE）菌株，并评价其酶鸡尾酒对阿拉伯木聚糖的降解能力。研究人员分离并系统表征了一株新菌株 Bacillus altitudinis ZH-1。通过对培养基和培养条件进行单因素逐一优化，与未优化Luria-Bertani（LB）培养基中获得的活性相比，FAE活性显著提高15.78倍。基因组分析显示103个独特的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzyme, CAZyme）编码基因，包括内切木聚糖酶（endoxylanases）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidases）和三个推定FAE。酶学性质研究表明，胞外酶鸡尾酒呈现半纤维素酶主导特征，且在测定条件下未检测到β-木糖苷酶（β-xylosidase）活性；三种关键酶在pH 6.0和50 °C下均保持其最大活性的76%以上。在不溶性小麦阿拉伯木聚糖（insoluble wheat arabinoxylan）降解中，酶鸡尾酒释放L-阿拉伯糖（69.00 mg/g底物）和木寡糖（xylooligosaccharides, XOS）等价组分（244.00 mg/g底物），二者合计占总还原糖的99.57%，同时释放阿魏酸（ferulic acid, FA）（1.23 mg/g底物）。当应用于脱淀粉麦麸（de-starched wheat bran）时，该酶鸡尾酒获得的还原糖产量与商业酶CTec2相当，同时产生显著更高水平的L-阿拉伯糖和XOS。这些发现表明，ZH-1酶鸡尾酒是一种靶向阿拉伯木聚糖的生物催化剂，在测定条件下未检测到β-木糖苷酶活性，在从农业残留物生产高价值功能糖和FA方面显示出有前景的潜力。

研究背景与问题：阿拉伯木聚糖（arabinoxylan, AX）是谷物细胞壁和农业残留物中主要半纤维素多糖之一，广泛存在于麦麸、玉米麸等。AX作为膳食纤维与益生元、改善肠道健康和调节血糖等健康益处相关。AX丰富农业残留物可作为廉价原料生产抗氧化阿魏酸（ferulic acid, FA）和功能糖，如益生元木寡糖（xylooligosaccharides, XOS）和低热量甜味剂L-阿拉伯糖。XOS可选择性刺激有益肠道菌群增殖；L-阿拉伯糖作为低升糖指数甜味剂有助于抑制餐后血糖升高；FA是植物细胞壁中主要酚酸之一，在AX丰富植物生物质中酯结合含量通常约为1–30 mg/g干生物质，具有抗氧化、抗炎和神经保护等生物活性。AX主要由β-1,4-木聚糖主链和阿拉伯糖残基组成，阿拉伯糖残基部分被FA酯化。FA还可与木质素单体进一步交联，形成木质素-碳水化合物复合物（lignin-carbohydrate complex, LCC），这是导致AX丰富农业残留物酶转化效率低的关键因素。高效转化不仅需要木聚糖酶，还需要侧链切割酶，尤其是阿拉伯呋喃糖苷酶和FAE。FAE特异性水解FA与阿拉伯糖残基间的酯键，破坏LCC中FA介导的交联，降低底物顽抗性并改善酶可及性。尽管已从土壤、青贮、羊瘤胃和小鼠粪便等多种来源分离产FAE微生物，但仅有有限野生型细菌菌株在液体发酵中FAE活性超过1000 U/L，因此持续筛选高活性FAE生产菌株仍必要。酒糟是中国白酒发酵的主要固体副产物，富含半纤维素（主要为AX）和高水平酯化FA，并存在具强降解能力的独特微生物群落。已从中国传统发酵系统分离若干FAE产生微生物，包括 Acetobacter、Klebsiella 和 Penicillium 等，也从土壤等来源获得高效FAE生产者，如 Bacillus pumilus SK52.001（195 U/L）和 Aspergillus terreus（6700 U/L）。然而，从酒糟中分离高FAE活性微生物并优化发酵产酶仍 largely unexplored。在此背景下，研究人员报道了从白酒酒糟中首次分离并表征新型产FAE菌株 Bacillus altitudinis ZH-1，系统优化其发酵条件，进行全基因组测序，表征胞外酶鸡尾酒，并评价其对模型和天然AX丰富底物的水解性能，与商业酶CTec2比较。结论表明ZH-1胞外酶鸡尾酒在测试条件下无检测到β-木糖苷酶活性，是高效选择性生物催化剂，可用于从农业残留物生产高价值功能糖，并为麦麸增值提供新工具。

关键技术方法概括：样本于2024年3月采自中国河南省洛阳市伊川县河滨街道某浓香型（Nongxiangxing）白酒厂全发酵周期结束后蒸馏废弃酒糟；从室外酒糟堆三个不同位置取三个独立样品，冰上2 h内运回，4 °C保存，24 h内分离。研究人员通过稀释涂布、LB琼脂分离，以阿魏酸乙酯（ethyl ferulate, EFA）筛选平板透明圈筛选FAE阳性菌；16S rRNA基因测序和系统发育分析；纳米孔全基因组测序、组装注释、CAZyme注释及dDDH和OrthoANIu分类比较；采用单因素逐一优化培养基、麦麸粒径、初始pH、搅拌速度、温度和培养时间；制备胞外酶鸡尾酒并测定底物特异性、温度和pH对XYL、ABF和FAE影响；以不溶性小麦阿拉伯木聚糖（I-WAX）和脱淀粉麦麸（DSWB）进行水解，使用DNS法、HPLC和TLC分析产物，并与CTec2比较。

3.1 产FAE菌株ZH-1的分离与鉴定：从白酒酒糟获得50株细菌，2株在EFA平板形成透明圈。ZH-1在72 h透明圈直径3.6 cm、菌落0.6 cm，酶活指数（EI）为6.0，ZH-2的EI为3.5。ZH-1的EI高于已报道 Penicillium rubens NRRL-1951（约5.5，12天）、七株亚马逊雨林真菌（1.91–3.83，96 h）和 Penicillium oxalicum M1816（近3.0，72 h）。16S rRNA基因与 Bacillus altitudinis 41KF2b^T 100.00%一致，系统发育聚类支持。全基因组分型显示，ZH-1与 B. altitudinis 41KF2b^T 的dDDH为95.40%，OrthoANIu为98.50%，G + C含量差异仅0.12%，高于物种界定阈值；与 B. pumilus ATCC 7061^T 和 B. safensis subsp. osmophilus CECT 9344^T 的比较低于阈值。结论：ZH-1为 Bacillus altitudinis，是首例从白酒酒糟报道的产FAE B. altitudinis，扩展了FAE生产微生物资源多样性。

3.2 产FAE发酵条件优化：最佳培养基为葡萄糖30 g/L、酵母提取物60 g/L、麦麸30 g/L、KCl 0.05 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.05 g/L、K₂HPO₄ 0.10 g/L。18目麦麸产酶最高，比未处理高1.33倍；50目和70目降至18目的70.49%和56.45%。pH 7.5最高，pH 6.5–8.5保持高水平，pH 9.5降至最大62.84%。静置培养显著高于摇动，100、150、200 rpm分别为静置的53.29%、61.38%、67.71%。34 °C、72 h最高FAE活性1194.79 U/L，比未优化LB（75.70 U/L）提高15.78倍。37 °C和40 °C峰值较早（48 h）但较低（848.04和692.97 U/L）；72 h时分别为34 °C的64.68%和51.32%。与已报道菌株比较，ZH-1活性高于多数细菌如 Bacillus pumilus SK52.001（195 U/L）、Lactiplantibacillus pentosus（7.11 U/L）、Klebsiella oxytoca Z28（35 U/L），也高于 Humicola grisea var. thermoidea（470 U/L）和 Penicillium brasilianum IBT-20888（225 U/L）；仅 Aspergillus terreus（6700 U/L）更高但需120 h。结论：ZH-1是迄今最高效细菌FAE生产者之一，短时间高产，支持低成本工业产酶和麦麸增值。

3.3 基因组特征和CAZyme注释：完整基因组为单环染色体3,732,220 bp，G + C含量41.39%，预测3759个蛋白编码基因，平均872 bp，覆盖87.86%，81 tRNA和24 rRNA。eggNOG、GO、KEGG分别注释2962、2932、2723个基因。eggNOG主要功能未知、氨基酸运输代谢、一般功能预测、转录、碳水化合物运输代谢；GO主要催化活性、代谢过程、结合、细胞过程；KEGG主要氨基酸生物合成、双组分系统、ABC转运蛋白、碳代谢。CAZy注释106个家族分配，包括糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs）38、糖基转移酶（glycosyl transferases, GTs）35、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases, CEs）23、碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules, CBMs）5、辅助活性（auxiliary activities, AAs）3、多糖裂解酶（polysaccharide lyases, PLs）2；去除多域冗余后103个独特CAZyme编码基因，与其他 B. altitudinis 菌株相当。分55个亚家族。PDB同源分析预测关键CAZymes：纤维素分解酶包括内切β-1,4-葡聚糖酶和纤维二糖水解酶；半纤维素分解酶包括多个内切木聚糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和推定FAE，还有甘露聚糖酶。信号肽预测显示多数半纤维素降解酶含信号肽，可能分泌。三个CE1基因与已表征FAE序列同一性21.62%、22.69%、25.22%，覆盖71%、70%、24%，只能视为推定FAE，需生化验证。其中一个GE003466预测含信号肽。EFA平板透明圈提供胞外FAE功能证据，但责任基因未确认。

3.4 胞外酶鸡尾酒酶学性质：底物特异性显示对山毛榉木聚糖（beechwood xylan, BWX）87.70 U/mg和对pNPAf 25.22 U/mg最高，表明内切木聚糖酶（XYL）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（ABF）主导。阿拉伯聚糖酶0.61 U/mg、FAE 0.27 U/mg中等。纤维素酶活相对可忽略：CMC-Na 1.27 U/mg、pNPC 0.12 U/mg，分别为XYL的1.4%和0.14%。对pNPX或pNPG未检测活性，说明制备的胞外酶鸡尾酒无β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。整体呈半纤维素酶主导，靶向AX型底物。温度pH：XYL和ABF最适60 °C，FAE最适50 °C；XYL和ABF在50–70 °C有活性（50 °C>76%，70 °C>40%），FAE>50 °C急剧下降（60 °C为54%）。最适pH：XYL 6.0，ABF和FAE 7.0；FAE在pH 6.0–8.0高（>78%），pH 5.0降至56%。三种酶在pH 6.0和50 °C均>76%最大活性。仅表征初始pH和温度依赖酶活，未评估热稳定性等。XYL最适与 B. altitudinis X-10、XYL17、RS3025一致。

3.5 AX型底物水解：I-WAX模型，40 °C 1 h释放还原糖6.29 mg/mL（314.50 mg/g底物）、L-阿拉伯糖1.38 mg/mL（69.00 mg/g底物）、D-木糖0.03 mg/mL（1.50 mg/g底物）和FA 1.23 mg/g底物。温度和时间对总还原糖和L-阿拉伯糖影响不显著，对FA和木糖释放显著。40 °C 1 h FA产量比50 °C高2.62倍，12 h时高2.40倍。12 h FA显著降低，机制不清。TLC确认L-阿拉伯糖和聚合度≥2的XOS。40 °C 1 h各成分占总还原糖：XOS等价组分约77.63%，L-阿拉伯糖约21.94%，木糖极低。该XOS等价组分由差减法得到，非直接定量。主要产物99.57%为高价值功能糖（XOS等价组分和L-阿拉伯糖）及天然抗氧化FA，FA由体外酶解释放而非菌株产生。DSWB天然底物与CTec2比较：40 °C 48 h总还原糖无显著差异（ZH-1 3.51 vs CTec2 3.66 mg/mL；175.50 vs 183.00 mg/g底物）。单糖组成显著不同：ZH-1优先释放L-阿拉伯糖0.71 mg/mL（35.5 mg/g底物），CTec2主要产生葡萄糖0.82 mg/mL和木糖1.25 mg/mL；ZH-1仅痕量葡萄糖0.03和木糖0.24 mg/mL。CTec2可发酵糖比例58.04%，ZH-1仅27.91%，其中72.40%单糖池为L-阿拉伯糖。ZH-1水解物仍含大量寡糖（主要XOS），归因于无β-木糖苷酶。未检测到游离FA，原因待确定。与 B. altitudinis RS3025（碱性处理稻秆，30 °C 24 h，146.87 mg/g还原糖）和 X-10（100目麦秸，50 °C 30 min，14.22 mg/g）比较，ZH-1性能相当或更好。实用优势包括产生食品相关功能成分、无β-木糖苷酶可控制聚合度、与CTec2互补、利用低成本麦麸。但为实验室批次水解，需工艺优化和技术经济评价。

讨论与结论：讨论部分认为ZH-1酶鸡尾酒在生物炼制中具有优势：可产生XOS等价组分和L-阿拉伯糖等食品相关功能成分；无检测到的β-木糖苷酶活性防止XOS过度水解为木糖，便于控制终产物聚合度；与CTec2偏向释放可发酵单糖不同，ZH-1提供富含功能寡糖的互补产品谱；结合低成本麦麸，显示可持续、经济生产功能糖潜力。但结果来自实验室规模批次水解，需进一步工艺优化和技术经济评价。结论翻译：该工作证明 Bacillus altitudinis ZH-1 是一株有价值的产FAE菌株。基因组分析和酶谱共同表明，其胞外酶鸡尾酒以半纤维素酶为主，在测定条件下未检测到β-木糖苷酶活性。该特征使其在阿拉伯木聚糖生物转化中具有明显优势：有利于XOS等价组分积累，而不是进一步将其水解为木糖。水解试验进一步确认其从木质纤维素原料产生功能糖的能力，其性能与商业酶制剂CTec2相当，同时有利于目标功能糖积累。总体而言，研究人员的发现表明，菌株ZH-1是增值富含阿拉伯木聚糖农业残留物、用于食品相关和营养品应用的有吸引资源。进一步研究可指向酶鸡尾酒优化和工业应用放大研究。