《Foods》：A Machine Learning Approach to Predict Listeria monocytogenes Growth by Integrating FSSP and PMP Simulations: A Focus on t100 as a Possible Endpoint Parameters for Predictive Models
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：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）因其嗜冷特性及在广泛环境条件下生长的能力，是最具挑战性的食源性病原体之一；因此，食品生产者和监管机构始终在寻求降低风险的新策略。在此背景下，预测微生物学（predictive microbi
：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）因其嗜冷特性及在广泛环境条件下生长的能力，是最具挑战性的食源性病原体之一；因此，食品生产者和监管机构始终在寻求降低风险的新策略。在此背景下，预测微生物学（predictive microbiology）作为支持风险评估和食品安全管理的宝贵工具具有重要价值。本研究探讨了单核细胞增生李斯特菌种群增长2个对数数量级所需时间（t100）作为整合型时间-阈值终点的可行性，并开发了一种结合食品腐败与安全预测器（Food Spoilage and Safety Predictor，FSSP）和病原体建模程序（Pathogen Modeling Program，PMP）输出的模拟衍生建模框架。在基于实验设计（Design of Experiments，DoE）理论的初步分析之后，数据集扩展了300个额外模拟，并用于比较不同建模方法（如非线性模型和随机森林回归）。优化后的随机森林（Random Forest）显示出最佳的内部预测性能；温度和NaCl是主导预测因子，其次是亚硝酸盐和pH，而模拟来源和初始接种量显示出较低的附加贡献。一项独立的FSSP特异性分析表明，乳酸（该工具的输入变量之一）的纳入并未改善模型的预测性能。关于模型的准确性，值得提及的是，对于高t100值以及接近所代表环境空间边界的情况，误差有所增加。尽管如此，t100为整合异质模拟生长响应提供了一个有用的综合终点。然而，所提出的模型应被视为一种模拟衍生的元模型（metamodel），其性能仅通过内部交叉验证进行了评估。在将其应用于实际食品安全决策之前，需要在代表性食品基质中通过挑战试验（challenge tests）进行独立验证。
论文解读文章
一、研究背景与问题
预测微生物学代表了食品领域从传统实验室检测向基于数学模型的前瞻性、定量化方法的重要转变。该学科发展于20世纪80年代末至90年代初，Ratkowsky等人建立了温度与细菌生长速率之间的首次关联，随后Zwietering等人利用修正的Gompertz模型标准化了微生物生长的描述。预测微生物学帮助监管机构和行业进行定量风险评估，允许用户模拟关键场景（如运输过程中的电力故障），从而减少昂贵且缓慢的挑战试验的需求。当前该领域正朝着"微生物学4.0"方向发展，研究人员正在整合人工智能和基因组数据，以实现对复杂食品产品中特定微生物菌株行为的更精确预测。
单核细胞增生李斯特菌是食品安全中最重要病原体之一，其重要性源于李斯特菌病的严重性和该生物体高度的环境抵抗力。与许多其他细菌不同，单核细胞增生李斯特菌是一种普遍存在且嗜冷的病原体，这意味着它能在冷藏温度下存活和生长，使冷链成为不足的安全保障。此外，该病原体表现出在不利条件下发育的非凡能力，耐受高盐浓度和宽pH范围。这些特性对即食（Ready-to-Eat，RTE）产品构成持续风险。
在欧盟，该危害的制度化管理基于法规（EC）No 178/2002，该法规将风险分析确立为基本监管支柱。后续法规更新通过法规（EC）No 2073/2005引入了更严格的微生物标准，法规（EU）2024/2895则引入了自2026年7月1日起全面强制实施的重大创新。在此监管背景下，预测微生物学已成为风险评估和过程验证的重要决策工具。机器学习算法正在成为这些不断演进的模型的重要组成部分，人工智能算法如神经网络和随机森林能够识别环境变量之间的复杂非线性关系。因此，本研究旨在提出一种开发原创三级预测模型的首个方法，通过整合传统预测微生物学与机器学习方法，估算单核细胞增生李斯特菌的t100，即获得2个对数增长所需的时间。
二、研究内容与主要结论
研究人员开展了以下研究：首先基于实验设计（DoE）理论开发多变量实验设计，分析温度、pH、NaCl、亚硝酸盐和乳酸等多种环境因素及初始微生物浓度对单核细胞增生李斯特菌生长的同时影响。这些组合使用FSSP 4.0版和PMP在线工具进行模拟，随后通过Gompertz方程（经Zwietering等人和Corbo等人修正）进行动态建模，以估算t100值和其他拟合参数（生长速率和迟滞期）。在初步分析后，又进行了300个额外组合的模拟以扩展数据集。最终数据库包含428个模拟组合。
通过比较四种复杂度递增的方法——基于环境预测因子的非线性逻辑模型、包含模拟来源的非线性逻辑模型、允许来源与环境因素交互的逻辑公式以及随机森林回归——研究发现随机森林提供了最佳预测性能。优化后的随机森林通过重复5折交叉验证获得平均R2为0.724 ± 0.132，RMSE为4.05 ± 1.42天。温度和NaCl是主导预测因子，分别占归一化置换重要性的约39.7%和38.0%，其次是亚硝酸盐（14.6%）和pH（6.0%），而模拟来源和初始接种量的贡献非常小（分别为1.0%和0.7%）。FSSP特异性分析表明，乳酸的纳入并未改善模型性能。
三、关键技术方法
本研究采用的主要关键技术方法包括：基于DoE理论的多变量实验设计以系统研究因子交互作用；使用FSSP 4.0和PMP在线工具进行微生物生长模拟；通过经典和重新参数化的Gompertz方程进行非线性建模以估算动力学参数；使用Statistica for Windows 14.0进行DoE统计分析（Pareto图、期望函数轮廓和响应面分析）；使用Python 3.13.5和scikit-learn 1.8.0库进行随机森林回归、5折交叉验证、随机超参数优化、置换重要性计算和模型性能指标计算。
四、研究结果
4.1 FSSP模拟的期望函数轮廓
温度表现出最显著的影响；随着温度升高，比生长速率明显增加，迟滞期和t100参数逐渐减少。在期望图中，迟滞期和t100的曲线几乎完全重叠，表明在实验域内，t100的变化主要由迟滞期的变化驱动。pH表现出强烈的优化行为，从酸性条件向亚碱性值移动时，生长速率的期望值增加，同时导致迟滞时间和t100明显减少。NaCl表现出与pH相反的趋势，确认了显著的抑制作用。亚硝酸钠也表现出非常明显的剂量依赖性抑制影响。初始细胞浓度和乳酸在测试的实验范围内未显示出显著效应。
4.2 PMP模拟的期望函数轮廓
基于FSSP模拟结果，t100被选为进一步评估的合成生长行为描述符。t100的期望函数轮廓确认温度是对估计达到目标种群所需时间影响最强的因素，在10°C至25°C之间存在急剧下降。pH表现出严格渐进、线性和加性趋势。亚硝酸钠表现出显著非线性的剂量依赖性抗菌效应，在75 ppm以下增加适中，超过此值后抗菌作用急剧加速，在100-125 ppm附近显示临界阈值。
4.3 选择t100作为综合动力学终点
期望函数轮廓显示迟滞期和t100之间存在密切对应关系，但后者也纳入了后续生长阶段的贡献。因此，t100提供了一个单一的时间-阈值终点，反映其累积结果，可直接以时间表示并解释。
4.4 模拟数据集的扩展与协调
最终数据库包含428个模拟组合。FSSP报告的t100以天为单位，而PMP以小时为单位返回相应终点，因此所有PMP t100值均转换为天。FSSP数据集包含5个右删失条件，PMP实验设计包含重复的中心点组合，建模时仅保留一个代表性组合。
4.5 不同模型的比较
基本逻辑模型提供训练R2为0.373，交叉验证R2仅为0.028。包含模拟来源后，模型适度改善，训练R2提高至0.446，交叉验证R2提高至0.133。允许来源依赖交互作用后，模型达到训练R2为0.637和交叉验证R2为0.344。随机森林表现出更好的预测性能，训练R2接近0.97，交叉验证R2约为0.70，RMSE为4.5天。
4.6 模拟来源的贡献和乳酸在随机森林中的权重
温度和NaCl是主导预测因子，分别占38%和38.8%，其次是亚硝酸盐（15.5%）和pH（6.1%）。模拟来源和初始浓度贡献有限（<1%）。FSSP特异性分析显示，不含乳酸的模型平均R2为0.657 ± 0.249，RMSE为4.92 ± 1.32天，而含乳酸的模型R2为0.631 ± 0.262，RMSE为5.12 ± 1.38天，表明乳酸未改善性能。
4.7 随机森林的超参数优化和变量重要性
优化后的结构特征为最大树深度8、max_features = 0.85、min_samples_leaf = 1、min_samples_split = 3，最终模型使用1000棵树。优化后的随机森林达到平均训练R2为0.942，RMSE为1.96天；重复5折交叉验证产生R2 = 0.724 ± 0.132和RMSE = 4.05 ± 1.42天。袋外R2为0.759。温度占归一化置换重要性的39.67%，NaCl占38.03%，亚硝酸盐贡献14.58%，pH约占6.01%，模拟来源和初始接种量的贡献非常小。
4.8 随机森林在t100域的预测误差
观测值按t100值分为四分位数。预测性能在中等和相对较短的t100值下最高，第二四分位数的RMSE仅为1.52天，MAE为0.87天。上四分位数误差增加，RMSE增至7.45天，MAE增至4.49天，正平均残差表明模型在t100特别长时倾向于预测低于观测值的值。
4.9 适用性域
194个内部域组合的RMSE为1.26天，MAE为0.84天，而224个边界域组合的RMSE为6.03天，MAE为3.09天。两组平均残差均接近零，表明边界处预测性能下降主要与预测误差离散度增加有关，而非系统性过度或欠预测。
4.10 最终随机森林模型和图形表示
最终模型使用温度、pH、NaCl浓度、亚硝酸盐浓度、log10转换的初始细胞浓度和模拟来源作为自变量。响应面显示在逐渐不利于单核细胞增生李斯特菌生长的条件组合下（温度降低和盐浓度增加），预测t100显著增加，突出了关系的非线性特征。
五、讨论与结论
本研究的主要目标是确定能够整合单核细胞增生李斯特菌生长动力学不同组成部分的动力学终点，并评估该终点是否可以使用两个不同预测微生物学平台生成的数据进行建模。结果支持使用t100作为有用的时间-阈值描述符。FSSP和PMP的整合不是基于两个平台等价的假设，而是将模拟来源明确纳入建模策略。随机森林提供了最佳预测性能，温度和NaCl是主导预测因子。乳酸因其仅在FSSP中可用而未纳入综合模型。预测误差在t100值较高或接近环境空间边界时增加。研究存在若干局限性，最主要是所有观测值均来自FSSP和PMP模拟，交叉验证仅量化模拟数据集内的内部预测性能，不构成独立实验验证。独立实验验证是必要的下一步，挑战试验将允许将模型预测与独立于FSSP和PMP的观测值进行比较。本研究的主要贡献是方法学层面的：结果支持t100作为整合的时间-阈值终点，展示了在明确考虑模拟来源的同时组合FSSP和PMP异质输出的策略，并表明优化后的随机森林能够以显著优于所评估参数模型的内部预测性能再现多维响应空间。
结论部分翻译：本研究支持使用t100（定义为单核细胞增生李斯特菌种群增长2个对数所需时间）作为整合的时间-阈值终点，能够结合微生物适应和后续生长的信息，允许将来自两个来源（FSSP和PMP）的输入组合到共同建模框架中。优化后的随机森林提供了最佳的内部预测性能，重复5折交叉/内部验证产生平均R2为0.724 ± 0.132和RMSE为4.05 ± 1.42天。温度和NaCl是主导预测因子，而模拟来源具有较小的预测贡献。同样，FSSP特异性分析表明，在研究的模拟域内，乳酸的纳入未改善模型性能。模拟分析还识别了一些限制，因为预测误差在t100值较高或接近所代表环境空间边界时增加；最重要的是，该模型是从模拟数据设计和开发的，因此需要进行外部验证和一些确认性挑战试验，以评估在真实场景中可能的应用。
