脐带血3-epi-25(OH)D?与10岁孤独症相关特质维度关联的探索性队列研究：KLOTHO出生队列的二次分析

《Nutrients》：The Association Between Energy Balance and Body Composition Changes in Recruits During Marine Corps Basic Training

　　

： 背景：25-羟基维生素D?的C3差向异构体[3-epi-25(OH)D?]可在母体和脐带循环中检测到，但其是否与后续神经发育相关尚不明确。目的：在KLOTHO出生队列中探索脐带血3-epi-25(OH)D?与10岁时家长报告的孤独症相关特质维度之间的关联。方法：本二次分析采用前瞻性收集的围产期样本和10年问卷数据。维生素D代谢物通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行定量并实现差向异构体分离。澳大利亚阿斯伯格综合征量表（Australian Scale for Asperger's Syndrome）以维度方式使用，而非用于诊断。研究人员进行了Spearman相关性分析、对13个独立双变量比较进行错误发现率（FDR）校正、支持性线性回归、性别分层分析以及更严格的记录链接敏感性分析。结果：共有87名后代（41名男孩和46名女孩）获得可用数据。脐带血3-epi-25(OH)D?与认知领域得分呈负相关（Spearman ρ = ?0.412；p < 0.001；Benjamini–Hochberg q = 0.001）。未校正回归估计值亦为负向（B = ?0.285；95% CI，?0.458至?0.112；p = 0.002），但该关联在协变量校正后减弱，且所有校正后置信区间均包含零。更严格的记录链接分析仍具有显著性（n = 84；ρ = ?0.350；p = 0.001）。男孩中的相关性数值上强于女孩，但性别间比较未达显著性（p = 0.075）。社交和情感特质方面亦观察到正相关（ρ = 0.302；q = 0.023），表明各领域方向不一致；三分位数分析无显著性。结论：在未校正的秩次分析中，脐带血3-epi-25(OH)D?与较低认知领域得分相关，但缺乏稳定的校正后线性证据、领域模式不一致以及样本量较小限制了结果的解释。这些发现仅具有假设生成意义，不代表因果关系、性别特异性效应或临床实用性。

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一、研究背景与问题

孤独症相关特征在人群中呈维度分布，涵盖社交互动、沟通、兴趣局限以及认知和运动筛查领域所捕捉的特征，其成因涉及遗传与环境因素在产前和产后发育过程中的交互作用。维生素D受体（VDR）及参与维生素D激活和分解代谢的酶已在神经组织中被证实，为维生素D信号通路影响神经元分化、神经递质信号、突触成熟和神经免疫过程提供了合理的生物学背景，但这并不能直接证明循环中特定维生素D差向异构体会影响认知特质。

关于母体和新生儿维生素D浓度与后续神经发育关联的人类研究结果不一。观察性研究报告了与语言、认知、注意力、行为或孤独症相关结局的关联，而其他队列和遗传学分析在调整后发现关联微弱或为零。一项随访至儿童10岁的随机试验发现，干预前母体25(OH)D与部分结局存在关联，但高剂量与标准剂量产前维生素D?补充对孤独症或注意缺陷多动障碍（ADHD）诊断并无益处。近期系统综述报告了产前维生素D状态与孤独症相关结局之间存在人群水平关联，但暴露测量、混杂因素和结局定义的差异仍限制因果推断。

大多数流行病学研究测量常规25-羟基维生素D[25(OH)D]或总25(OH)D值。C3差向异构体3-epi-25(OH)D?在立体化学上与25(OH)D?不同，在缺乏适当色谱分离的检测方法中可能共洗脱。差向异构体浓度可在母体、脐带和婴儿循环中测量，并在围产期发生变化。配对母婴样本研究表明，胎儿-胎盘合成或处理过程而非母体差向异构体池的简单被动经胎盘转移，可能促成脐带血浓度。这一现象在分析上具有重要意义，因为未分离的测量可能错误分类常规维生素D状态；在概念上，差向异构体可能代表围产期代谢的不同侧面。

母体-胎盘-胎儿轴为差向异构体特异性的纵向研究提供了主要依据。母体底物可用性、补充剂使用、季节、妊娠生理以及胎盘转运和酶促过程共同影响分娩时可测量的维生素D代谢物。脐带血3-epi-25(OH)D?因此可能作为胎儿发育期代谢暴露的代理指标，而非作为已确立的神经活性分子。由于神经分化、突触组织和神经免疫发育的某些方面始于出生前，此类暴露标志物可能与后续发育特质存在统计学关联，但这一通路是间接且未经检验的。具体知识空白在于：经分析分离的脐带血3-epi-25(OH)D?是否与后续维度性神经发育特质存在前瞻性关联，且超越总25(OH)D已检验的范围。研究人员因此对KLOTHO队列进行了探索性、代谢物特异性的二次分析。

二、研究设计与主要结论

KLOTHO是2011年在希腊塞萨洛尼基亚里士多德大学妇产科第一系产科单元建立的前瞻性母婴出生队列。分娩时采集母体血液和脐带血。10年随访工作簿包含119条记录，经记录完整性审查后，主要分析样本包括87名后代（41名男孩和46名女孩）。研究经塞萨洛尼基亚里士多德大学医学院机构审查委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》。

研究使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对母体血清和脐带血清中的25(OH)D?、3-epi-25(OH)D?和25(OH)D?进行定量，该方法能够实现C3差向异构体的色谱分离。主要暴露为脐带血3-epi-25(OH)D?，单位为nmol/L。10岁时由家长完成澳大利亚阿斯伯格综合征量表，该工具包含24个计分条目，涵盖五个领域：社交和情感能力（10项，0–60分）、沟通技能（6项，0–36分）、认知技能（3项，0–18分）、特定兴趣（3项，0–18分）和运动技能（2项，0–12分）。得分越高表示孤独症相关特征越多。该工具以维度方式作为筛查工具使用，不用于建立孤独症谱系障碍诊断。

主要发现为：脐带血3-epi-25(OH)D?与认知领域得分呈负相关（ρ = ?0.412；p < 0.001；q = 0.001），该关联在13个独立比较的FDR校正后仍具显著性。未校正回归估计为每升高1 nmol/L对应认知得分降低0.285分（B = ?0.285；95% CI，?0.458至?0.112；p = 0.002），但校正性别、性别加母体教育水平或性别加季节后估计值减弱，所有校正后置信区间均包含零。三分位数分析无显著性（Kruskal–Wallis H = 2.745；p = 0.253）。更严格的记录链接敏感性分析（n = 84）中关联仍显著（ρ = ?0.350；p = 0.001）。男孩中相关性数值上更强（ρ = ?0.611；p < 0.001），女孩为ρ = ?0.304（p = 0.040），但正式性别间比较未达显著性（Fisher z = ?1.78；p = 0.075）。此外，脐带血3-epi-25(OH)D?与社交和情感得分呈正相关（ρ = 0.302；q = 0.023），方向与认知领域相反。母体25(OH)D?亦与认知得分呈负相关（ρ = ?0.296；p = 0.005；q = 0.023）。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）实现C3差向异构体的色谱分离和定量；Spearman秩相关分析处理右偏态暴露数据；Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正控制多重比较；Fisher z变换计算相关系数置信区间和进行性别间比较；普通最小二乘（OLS）回归模型评估协变量校正后的线性关联；Kruskal–Wallis检验评估三分位数趋势；以及记录链接敏感性分析。样本来源为KLOTHO出生队列，该队列于2011年在希腊塞萨洛尼基建立，10年随访时收集问卷数据。

四、研究结果

3.1 分析样本：主要清洁分析样本包括87名后代。脐带血3-epi-25(OH)D?呈右偏态分布，中位数为1.72 nmol/L（IQR，0.50–3.65）。认知领域得分中位数为5.00（IQR，0.00–6.00）。

3.2 维生素D代谢物与认知领域得分：脐带血3-epi-25(OH)D?与认知领域得分的绝对相关性最大（ρ = ?0.412；p < 0.001；q = 0.001）。母体25(OH)D?亦呈负相关（ρ = ?0.296；p = 0.005；q = 0.023）。其余母体和脐带代谢物相关性未达到5%错误发现率阈值。

3.3 脐带差向异构体与孤独症相关特质领域：认知领域呈最大绝对负相关（ρ = ?0.412；q = 0.001）。社交和情感得分呈正相关（ρ = 0.302；q = 0.023）。沟通、特定兴趣、运动特征和复合得分的估计值较小，未达到错误发现率阈值。

3.4 性别分层估计：男孩中负相关更大（ρ = ?0.611；p < 0.001），女孩为ρ = ?0.304（p = 0.040）。但正式性别间比较无统计学显著性（Fisher z = ?1.78；p = 0.075），数据支持男孩中点估计更大，但未确立性别效应修饰。

3.5 回归和三分位数分析：粗模型中每升高1 nmol/L脐带血3-epi-25(OH)D?对应认知得分降低0.285分（B = ?0.285；SE = 0.087；95% CI，?0.458至?0.112；p = 0.002）。校正性别后估计减弱（B = ?0.174；p = 0.188），校正性别和母体教育（B = ?0.183；p = 0.204）或性别和季节（B = ?0.183；p = 0.185）后亦然。仅男孩模型中未标准化系数范围为?1.040至?1.126，在粗模型和分别校正母体教育或季节后仍具名义显著性，但基于41名男孩，应视为探索性。三分位数分析中，最低三分位平均认知得分为5.31 ± 3.15，中间为4.38 ± 4.24，最高为3.09 ± 3.48，总体差异不显著（p = 0.253）。更严格记录链接分析（n = 84）中焦点秩相关为ρ = ?0.350（p = 0.001）。

五、讨论与结论

讨论部分指出，该探索性分析在KLOTHO队列中识别出脐带血3-epi-25(OH)D?与10岁时家长报告的孤独症相关特质认知领域得分之间的负向秩关联。Spearman关联在FDR校正和更严格记录链接筛查后仍显著，但初始显著的粗线性估计在调整后减弱，所有校正后置信区间均包含零。三分位数分析无显著性，各领域相关方向不一致，性别间直接对比亦无显著性。这些模式未证明稳定的独立线性剂量-反应关系。

研究优势包括纵向母婴队列设计、分娩时采样、可分辨差向异构体的LC-MS/MS方法、10年随访、多结局报告、FDR校正、直接性别间比较和明确的记录链接敏感性分析。局限性包括样本量适中（n = 87）、认知领域仅含三个家长报告条目、母体维生素D补充剂、膳食摄入、孕前肥胖、妊娠并发症、社会经济因素和父母神经发育或精神特征未全面控制、有界结局和右偏态暴露可能挑战OLS假设、三分位数趋势不显著、协变量调整后估计减弱以及各领域关联方向相反。

研究结论为：在KLOTHO队列中，较高脐带血3-epi-25(OH)D?浓度与10岁时较低家长报告认知领域得分在未调整秩次分析中相关，该关联在FDR校正和更严格记录链接筛查后仍存在。然而，调整后线性估计包含零、三分位数分析为阴性、特质领域方向不一致且性别交互未确立。这些探索性数据未证明因果或临床可操作关联，需要以预设分析和更全面的混杂控制进行独立重复验证。