PTPRS作为破伤风神经毒素逆行运输受体介导其入侵中枢神经系统的机制与靶向干预

《Cell》：PTPRS mediates invasion of tetanus neurotoxin into the central nervous system

　　

破伤风神经毒素（TeNT）通过运动神经元（motoneurons）逆行运输侵入中枢神经系统（CNS）。是否存在宿主因子调控其运输长期未知。研究人员利用pull-down与质谱（mass spectrometry）分析，并建立基于荧光素酶（luciferase）的体内运输 assay，鉴定出受体型蛋白酪氨酸磷酸酶σ（PTPRS; PTPσ）为TeNT在运动神经元中的逆行运输受体。全局或运动神经元特异性PTPRS敲除（KO）在小鼠模型中消除TeNT进入CNS。PTPRS-TeNT相互作用发生于内体（endosomes），阻止毒素转位（translocation）并指导神经元内运输。结构研究证实TeNT轻链（LC）与belt区域结合PTPRS的免疫球蛋白（Ig）结构域。破坏TeNT-PTPRS相互作用阻断TeNT向脊髓运输；与之一致，PTPRS结合缺陷TeNT突变体引起肉毒样弛缓性瘫痪（botulism-like flaccid paralysis）。因此，PTPRS是介导TeNT运输入CNS的宿主因子，揭示了一条可用于TeNT暴露后干预及CNS药物递送的可靶向通路。

研究背景方面，哺乳动物中枢神经系统受严格保护，但狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒和破伤风神经毒素（Tetanus neurotoxin, TeNT）等可经外周神经元入侵。TeNT由 Clostridium tetani 产生，导致破伤风，典型表现为痉挛性瘫痪（spastic paralysis）；一旦进入运动神经元，目前无获批疗法。TeNT与肉毒神经毒素（Botulinum neurotoxins, BoNTs）结构相似，含轻链（Light chain, LC）、转运结构域 H_N 与受体结合结构域 H_C。TeNT在运动神经元内逆行运输至脊髓，再进入抑制性神经元阻断神经递质释放。过去研究多聚焦 H_C/T 结合因子，而全长TeNT体内效率更高，提示存在未知宿主因子调控其运输。该论文发表于《Cell》，研究人员通过系统性鉴定明确 PTPRS 为 TeNT 逆行运输受体，并阐明其结构基础、功能意义及干预潜力。

关键方法方面，研究人员使用小鼠脑裂解液进行生物素化全长TeNT pull-down 与比较质谱；用生物层干涉（Biolayer interferometry, BLI）验证直接结合；构建 tamoxifen 诱导的条件敲除（cKO）小鼠、ChAT-Cre 与 Vgat-Cre 细胞类型特异性敲除小鼠、CRISPR-Cas9 种系 PTPRS 敲除小鼠；建立 NanoLuc 融合催化失活TeNT的体内逆行运输荧光素酶 assay；进行晶体学解析 LCH_N/T 与 PTPRD-Ig 复合物结构；并利用脂质体染料泄漏 assay、共聚焦与时间序列活细胞成像分析运输与转位。

研究结果方面，TeNT pulls down PTPRS and PTPRD：研究人员用生物素化全长TeNT从小鼠脑裂解液 pull-down，质谱显示 PTPRS 与 PTPRD 为最显著候选，免疫印迹确认 TeNT 而非 H_C/T 拉下内源 PTPRS。LCH_N/T binds to the Ig domains of PTPRS：BLI 与细胞结合实验表明 TeNT 及 LCH_N/T 结合 PTPRS/PTPRD 的 Ig1–3 结构域，不结合 LAR/PTPRF，亲和力 PTPRS 强于 PTPRD，且结合不依赖神经节苷脂。PTPRS is required for TeNT in vivo：tamoxifen 诱导 cKO 中 Ptprs 单敲或三敲小鼠对 10 pg TeNT 痉挛反应显著降低，Ptprd/Ptprf 双敲与野生型相似，对 BoNT/A 敏感性不变。PTPRS KO mice are resistant to TeNT：两种种系 PTPRS KO 小鼠注射 TeNT 无瘫痪，杂合子表型减弱，BoNT/A 反应不受影响，说明 PTPRS 不可或缺且 PTPRD 不能补偿。PTPRS in motoneurons is required for TeNT：ChAT-Cre Ptprs 敲除运动神经元后 TeNT 无瘫痪，Vgat-Cre Ptprs 敲除抑制性神经元仍瘫痪，证明 PTPRS 在运动神经元而非抑制性神经元中必需。PTPRS is not required for TeNT binding to motor nerve terminals：体内与离体膈肌神经肌肉接头（NMJ）实验显示 TeNT 结合 NMJ 由 H_C/T 主导，PTPRS KO 不影响结合。PTPRS can bind to TeNT under endosomal pH：BLI 显示 PTPRS 在 pH 6.5、5.5 仍强结合 TeNT；TrkC 在 pH 5.5 解离而 TeNT 仍可结合，说明内体低 pH 释放内源配体后 PTPRS 结合 TeNT。PTPRS binding inhibits TeNT translocation：脂质体染料泄漏 assay 中 S-Ig 抑制 TeNT 膜穿透，pH 4.0 时抑制消失，表明 PTPRS 在内体 pH 阻止转位。TeNT co-traffics with PTPRS in neurons：皮质神经元中 TeNT 与 HA-PTPRS 共定位，活细胞成像显示两者沿轴突向胞体共运输。A luciferase-based assay for assessing TeNT transport in vivo：NanoLuc-TeNT 在腰髓与坐骨神经检出信号，BoNT/A 融合蛋白无信号，实现生理剂量体内运输定量。PTPRS is essential for TeNT trafficking into the spinal cord：S-Ig、LCH_N/T 竞争阻断运输；cKO、种系 KO、ChAT-Cre KO 均使坐骨神经与脊髓信号消失。PTPRS undergoes retrograde transport in vivo：nLuc 标记抗 PTPRS 抗体肌注后在坐骨神经与脊髓富集，证明 PTPRS 本身可逆行运输。The PTPRS-TeNT complex can be shed by α-secretases：PMA 或 A23187 促进表面 TeNT 减少，ADAM10/17 抑制剂 GW280264X 阻止该过程，说明 ADAM 家族 α-secretase 可剪切 PTPRS-TeNT 复合物。The PTPRS antibody blocks TeNT in the spinal cord：脊髓内注射抗 PTPRS 抗体可在 TeNT 暴露后减轻症状并提高存活。Structural basis for TeNT-PTPRS interactions：LCH_N/T·D-Ig 晶体结构显示 Ig1 结合 H_N belt 区、Ig2 结合 LC/T，N74/S75 残基差异解释 PTPRD 亲和力较低。PTPRS-binding-deficient TeNT mutants cannot traffic into the spinal cord：界面突变 m13、m20 不结合 PTPRS，NMJ 结合正常，但无法进入坐骨神经与脊髓。A PTPRS-binding-deficient TeNT mutant induces flaccid paralysis：活性 T_m13 体内引起 botulism-like flaccid paralysis，而野生 TeNT 引起 spastic paralysis，证明 PTPRS 结合决定破伤风与肉毒症状差异。

讨论部分总结为，TeNT 经 H_C 结合 NMJ 进入内体，低 pH 使 PTPRS 脱离内源配体并结 TeNT，PTPRS 抑制转位并共运输，经转胞吞与 ADAM 剪切释放，再被抑制性神经元摄取并在更酸区室解离转位。PTPRS 介导的高选择性逆行运输可被生理剂量饱和，不同于 BoNT 非选择通路；内体 pH 下受体-货物稳定结合可能是神经元逆行分选关键。该研究揭示 PTPRS 生理与药物递送价值，同时承认转胞吞、剪切及抑制性神经元内事件仍需进一步验证。

研究结论部分翻译为：破伤风是人类与动物中两种经典疾病，本研究表明 PTPRS 是介导 TeNT 经运动神经元逆行运输进入脊髓的宿主因子。PTPRS 结合抑制 TeNT 在运动神经元中转位，并使其沿轴突共运输；PTPRS 结合缺陷突变体丧失脊髓入侵能力并产生肉毒样弛缓性瘫痪。该发现确立 PTPRS 为 TeNT 中枢入侵的核心宿主因子，并为暴露后治疗与中枢神经系统药物递送提供可靶向通路。