CGRP–RAMP1/CALCRL信号驱动TGF-β2介导的免疫逃逸与胰腺癌进展

《International Journal of Molecular Sciences》：CGRP–RAMP1/CALCRL Signaling Drives TGF-β2-Mediated Immune Evasion and Pancreatic Cancer Progression

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）以广泛的神经重塑和深度免疫抑制的肿瘤微环境为特征，这两者均促进疾病进展和治疗耐药。然而，伤害感受器来源的信号是否直接重编程PDAC细胞以促进免疫逃逸仍知之甚少。在此，研究人员识别出一种先前未被认识的肿瘤内在神经免疫机制，该机制由降钙素基因相关肽（CGRP）通过PDAC细胞上的受体复合物RAMP1/CALCRL信号所驱动。CRISPR/Cas9介导的Ramp1或Calcrl缺失在体外不改变PDAC细胞增殖，但在免疫健全小鼠中显著抑制肿瘤生长并延长生存期。这些抗肿瘤效应在免疫缺陷宿主中消失，表明CGRP信号的促肿瘤功能依赖于完整的宿主免疫系统。一致地，肿瘤细胞特异性Ramp1或Calcrl缺失重塑了肿瘤免疫微环境，增强了CD4⁺和CD8⁺ T细胞的效应活性。机制上，CGRP刺激以RAMP1依赖性方式促进PDAC细胞表达和分泌TGF-β₂。肿瘤来源的TGF-β₂随后以旁分泌方式抑制CD8⁺ T细胞活化和细胞毒性功能，而RAMP1的遗传破坏或TGF-β信号的药理学抑制可解除这种免疫抑制。总之，这些发现定义了一个CGRP–RAMP1/CALCRL–TGF-β₂信号轴，通过该轴，伤害性输入被转化为肿瘤驱动的适应性免疫逃逸。该通路揭示了神经信号与PDAC进展之间一个先前未被充分认识的机制，并将CGRP受体信号确定为恢复抗肿瘤免疫和改善PDAC对免疫治疗响应性的潜在治疗靶点。

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的实体肿瘤之一，以神经周围浸润（PNI）和肿瘤微环境（TME）中广泛的神经重塑为特征。PDAC中伤害感受神经纤维密集浸润，释放降钙素基因相关肽（CGRP）等神经肽。既往研究显示CGRP可通过RAMP1/CALCRL复合体作用于肿瘤相关成纤维细胞（CAFs），抑制IL-15分泌从而削弱NK细胞功能；也可直接促进CD8⁺ T细胞耗竭。然而，伤害感受来源的信号是否直接作用于PDAC肿瘤细胞并驱动免疫逃逸，此前尚不明确。本研究旨在回答这一问题。

研究人员发现，人和小鼠PDAC细胞系均高表达CGRP受体RAMP1和CALCRL；敲除Ramp1或Calcrl不影响体外增殖，但在免疫功能健全小鼠中显著抑制皮下肿瘤生长并延长生存，而在免疫缺陷SCID小鼠中该效应消失，说明该通路依赖适应性免疫。流式细胞术显示，Ramp1或Calcrl缺失重塑肿瘤免疫微环境，增强CD4⁺和CD8⁺ T细胞效应功能。RNA测序和qPCR证实Ramp1缺失下调Tgfb2等基因表达。CGRP刺激以RAMP1依赖性方式促进PDAC细胞分泌TGF-β₂，TGF-β₂以旁分泌方式抑制CD8⁺ T细胞活化、细胞因子和细胞毒性分子产生；Ramp1缺失或TGF-β受体抑制剂可解除抑制。该研究定义了CGRP–RAMP1/CALCRL–TGF-β₂信号轴，揭示伤害性感觉神经输入直接转化为肿瘤驱动的适应性免疫逃逸，为PDAC免疫治疗提供了新靶点。

关键技术方法：研究使用了人PANC-1、小鼠PANC02和KPC细胞系；C57BL/6J和SCID小鼠皮下移植瘤模型。通过CRISPR/Cas9技术（PANC02采用LentiCRISPRv2慢病毒系统，KPC采用核糖核蛋白电转）敲除Ramp1或Calcrl。利用流式细胞术分析肿瘤免疫微环境；对分选的肿瘤细胞（CD45^?CD326⁺）和免疫细胞（CD45⁺）进行RNA-seq及GO、GSEA分析；通过ELISA检测CGRP浓度和细胞因子水平；分离小鼠脾脏初始CD8⁺ T细胞，用重组TGF-β₂或条件培养基处理，检测T细胞功能。

### 2.1 RAMP1和CALCRL在胰腺癌细胞中高表达

通过qPCR检测多种伤害感受相关受体表达，发现RAMP1和CALCRL在人PANC-1、鼠PANC02和KPC细胞中相对高表达；TCGA数据库分析显示CALCRL转录本在人胰腺腺癌（PAAD）组织中显著上调；TISCH数据库两个独立单细胞RNA-seq数据集中，RAMP1主要分布于恶性肿瘤细胞簇；ELISA测定显示PANC02皮下肿瘤内CGRP蛋白浓度超过100 ng/g组织。

### 2.2 Ramp1/Calcrl缺失不影响体外PDAC细胞增殖

CCK-8细胞活力实验显示，无论是否添加CGRP，Ramp1缺失的PANC02细胞和Calcrl缺失的KPC细胞增殖速率与对照细胞无显著差异，说明CGRP信号不直接调控细胞自主生长。

### 2.3 胰腺癌细胞Ramp1/Calcrl缺失在免疫健全小鼠中抑制肿瘤生长

将野生型（gScramble）或Ramp1缺失PANC02细胞皮下接种至C57BL/6J小鼠后，所有来自三个不同sgRNA的Ramp1缺失细胞系均显著抑制肿瘤生长，部分小鼠未成瘤，并显著延长生存期；存活的无瘤小鼠可抵抗野生型PANC02再攻击。在免疫缺陷SCID小鼠中，Ramp1缺失不影响肿瘤生长和生存。Calcrl缺失KPC细胞在免疫健全小鼠中同样显著抑制肿瘤生长并延长生存，而在SCID小鼠中该效应消失。

### 2.4 Ramp1/Calcrl缺失重塑肿瘤免疫微环境

流式细胞术分析显示，在Ramp1缺失PANC02肿瘤中，CD8⁺和CD4⁺ T细胞浸润有增加趋势，IFN-γ⁺、TNF-α⁺及双阳性细胞比例显著升高；CD8⁺ T细胞上PD-1平均荧光强度显著下降。在Calcrl缺失KPC肿瘤中，CD8⁺和CD4⁺ T细胞浸润显著增加，细胞毒性分子Granzyme-B及效应细胞因子比例升高。

### 2.5 PDAC细胞Ramp1缺失消除TGF-β信号

对分选的肿瘤细胞和免疫细胞进行RNA-seq，GO分析显示Ramp1缺失肿瘤细胞中钙信号和生长因子通路改变；簇分析显示Tgfb2、Tgfb3和Bmp2显著下调，qPCR验证Tgfb2表达急剧下降。免疫细胞转录组显示适应性免疫应答和II型干扰素通路富集，T细胞效应基因Tnf、Ifng、Gzmb表达升高；GSEA显示IFN-γ应答增强。qPCR验证Ifng显著升高，Tnf、Gzmb和Prf1也呈升高趋势。

### 2.6 CGRP刺激肿瘤TGF-β₂表达抑制CD8⁺ T细胞效应功能

CGRP处理PANC02细胞后，Tgfb2转录和TGF-β₂蛋白分泌显著增加；Ramp1缺失细胞在该刺激下Tgfb2 mRNA和分泌水平远低于对照，说明CGRP经RAMP1调控TGF-β₂。重组TGF-β₂处理初始CD8⁺ T细胞可显著抑制IFN-γ、TNF-α和Granzyme B产生，并下调CD25和CD69表达，TGF-β受体激酶抑制剂SB-431542可逆转。用CGRP预处理的野生型PANC02条件培养基培养CD8⁺ T细胞，严重抑制其IFN-γ、Granzyme B和TNF-α产生；Ramp1缺失可解除该抑制，加入SB-431542同样完全恢复T细胞效应功能，表明CGRP–RAMP1诱导的TGF-β₂是PDAC细胞抑制CD8⁺ T细胞的关键旁分泌介质。

### 讨论与结论

讨论指出，既往研究建立了CGRP–CAF–IL-15轴抑制NK细胞的神经-基质回路，而该研究证明CGRP可直接作用于PDAC恶性上皮细胞，确立了一种肿瘤内在的神经免疫机制。阻断CGRP–CALCRL/RAMP1轴可增强T细胞浸润、效应功能及记忆形成，并降低PD-1表达，为联合免疫检查点阻断（ICB）治疗提供了依据。研究局限性包括：主要使用皮下移植瘤模型，需正位模型进一步验证；CGRP诱导TGF-β₂表达的胞内信号机制未完全阐明；未专门分析性别差异；CRISPR脱靶效应未通过靶向测序或全基因组方法评估，且CALCRL蛋白水平因抗体特异性不足未能独立验证；Ramp1与Calcrl表型强度差异可能源于细胞系固有差异。

结论：本研究将CGRP–RAMP1/CALCRL轴确定为PDAC免疫治疗中一个关键且可靶向的弱点。临床上，可考虑利用已批准的CGRP受体拮抗剂（如Rimegepant）阻断该轴，从源头上抑制肿瘤源性TGF-β₂分泌，阻止浸润CD8⁺ T细胞的旁分泌麻痹。该通路与TGF-β₂抑制策略相协同，可作为双重靶向框架，使“冷”肿瘤对免疫检查点阻断敏感化，从而增强当前癌症免疫疗法的疗效并改善PDAC患者生存。