氯沙坦对高脂饮食诱导的Sprague-Dawley大鼠肾脏多巴胺能系统与肾素–血管紧张素系统失衡及肾损伤的预防作用

《International Journal of Molecular Sciences》：Effects of Losartan on Renal Dopaminergic and Renin–Angiotensin System Alterations Induced by a High-Fat Diet in Sprague-Dawley Rats

　　

肾脏多巴胺能系统（renal dopaminergic system, RDS）促进尿钠排泄、利尿并发挥抗炎作用。高脂饮食（high-fat diet, HFD）摄入触发肾素–血管紧张素系统（renin–angiotensin system, RAS）。本研究旨在确定氯沙坦（losartan, L）是否预防RDS-RAS改变及其对HFD诱导的血压和肾损伤的影响。雄性Sprague–Dawley大鼠研究8周，分配至四组：对照组（control, C; n = 4）；HFD组（n = 6）：标准饮食中添加50% w/w牛脂；对照+氯沙坦（control + losartan, CL; n = 4）：饮用水中溶解30 mg/kg/day L；HFD+氯沙坦（HFD + losartan, HFDL; n = 6）：HFD + CL。（平均值±标准差；p < 0.05）。L预防以下变化：HFD诱导的收缩压（systolic blood pressure, SBP）和L-Dopa/多巴胺尿指数升高（HFD vs. C, p < 0.01；HFDL vs. HFD, p < 0.01）；OCTN-_1/2/3（novel organic cation transporters 1/2/3）表达降低（HFD vs. C, p < 0.01；HFDL vs. HFD, p < 0.05）；D₁DR（D1-like dopamine receptor）和Na⁺/K⁺-ATPase过表达（HFD vs. C, p < 0.01；HFDL vs. HFD：D₁DR p < 0.01；Na⁺/K⁺-ATPase p < 0.05），NF-κB₁（nuclear factor κB1）和TGF-β₁（transforming growth factor-β1）过表达（HFDL vs. HFD, p < 0.01）。L减轻近端小管改变和间质纤维化（HFDL vs. HFD, p < 0.01）。在慢性HFD摄入下，早期L给药预防肾脏多巴胺能系统改变和SBP升高，并减轻肾脏炎症和间质纤维化，反映其肾保护作用。

研究背景：全球范围内，饱和脂肪酸约占每日总能量摄入的10%，不同国家为2.3%–27.5%，中高收入国家因超加工食品占比较高而摄入最高。此类饮食与心-肾-代谢障碍风险增加相关，包括冠心病、内皮功能障碍、胰岛素抵抗和进行性肾损伤，主要由促炎、血脂异常和氧化效应介导。世界卫生组织建议限制饱和脂肪摄入低于总能量10%。HFD消费是代谢综合征（metabolic syndrome, MS）的主要因素之一。MS定义为至少存在以下代谢异常中的三项：高血糖、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、血压升高、腰围增加和全身炎症，并影响包括肾脏在内的多器官。肾脏对水电解质稳态和血压调节至关重要。HFD摄入诱导肾脏结构和功能改变，并促进动脉高血压。肾脏钠处理由神经、自分泌和内分泌因素控制，可分为促血管收缩与钠潴留及促血管舒张与尿钠排泄两类。传统认为肾内RAS通过AT₁受体（AT₁R）过度激活是钠重吸收、肾血管收缩和高血压的主要驱动因素。相反，RDS作为Ang II高血压作用的反调节系统具有保护作用。RDS主要位于近端曲小管（proximal convoluted tubules, PCT），通过D₁样受体（D1DR；D₁、D₃和D₅）促进尿钠排泄和利尿，并通过D₂样受体（D2DR；D₂和D₄）发挥抗炎作用，从而对抗Ang II的抗尿钠排泄和促炎作用。两系统功能拮抗，共同靶点之一是肾脏泵Na⁺, K⁺-ATPase，其改变与钠潴留和高血压相关。尿L-dopa/多巴胺比值被提出作为果糖诱导动脉高血压动物模型肾损伤的早期生物标志物。氯沙坦是安全、强效、选择性AT₁R拮抗剂，患者依从性高且临床结果可靠，但其能否在HFD诱导MS中调节RDS-RAS相互作用作为肾保护作用尚不清楚。研究假设：HFD诱导MS样表型大鼠中动脉高血压和肾损伤可能与RDS与RAS关系受损有关，表现为内源性肾内多巴胺可用性降低和通过AT₁R增强RAS，促进钠潴留和肾脏炎症。鉴于Ang II抑制肾脏多巴胺活性，研究人员进一步假设氯沙坦药理阻断RAS可预防HFD诱导的肾脏改变，并评估尿L-DOPA/多巴胺比值作为钠潴留、胰岛素抵抗和/或高血压状态中肾功能障碍标志物和/或预测因子的潜在效用。

研究目的与总体设计：研究旨在确定氯沙坦是否预防RDS-RAS改变及其对HFD诱导血压和肾损伤的影响。雄性Sprague–Dawley大鼠研究8周，分为对照组（C; n = 4）、HFD组（n = 6；标准饮食加50% w/w牛脂）、对照+氯沙坦组（CL; n = 4；30 mg/kg/day L溶于饮用水）和HFD+氯沙坦组（HFDL; n = 6；HFD + CL）。研究结论显示，慢性HFD摄入下，早期L给药预防RDS改变和SBP升高，减轻肾脏炎症和间质纤维化，反映其肾保护作用。该研究提示早期氯沙坦治疗在此实验模型中具有潜在肾保护意义，并支持尿L-Dopa/多巴胺指数作为相关标志物的可能价值。

关键技术方法：样本来源为雄性Sprague–Dawley大鼠（6周龄，180–200 g；Central Animal Facility, Facultad de Farmacia y Bioquímica—Universidad de Buenos Aires），研究8周，随机分为四组。测量体重、摄食、饮水和热量摄入；尾套法测定SBP；代谢笼收集尿液，眶后穿刺取血；HPLC测定尿L-Dopa和多巴胺；检测血糖、甘油三酯、胰岛素并计算TyG和HOMA-IR；评估ClCr、UNa⁺.V、FENa⁺和UACR；采用苏木精–伊红染色、Picrosirius红染色和透射电镜观察肾脏组织与超微结构；Western blot检测LAT2、OCT2、OCTN_1,2,3、D₁DR、D₂DR、AT₁R、Na⁺/K⁺-ATPase、TGF-β₁和NF-κB₁，以β-tubulin为内参；统计采用Student t检验、two-way ANOVA及Tukey多重比较、Pearson相关和线性回归。

研究结果：体重、摄食与血浆代谢参数方面，HFD显著增加体重，L在HFDL中预防该增加；L预防HFDL较HFD的食物摄入降低；HFD热量摄入较C增加，HFDL与HFD间存在差异；水摄入无组间差异。HFD血浆代谢参数较C增加，HFDL中甘油三酯和胰岛素降低；CL较HFDL甘油三酯降低，提示L本身可改变该参数。HFD较C增加葡萄糖，L在CL较C降低葡萄糖，但HFDL较HFD未降低；TyG和HOMA-IR在HFD较C显著增加，L未显著改变。收缩压、尿L-Dopa/多巴胺指数与肾功能方面，HFD较C增加SBP和尿L-Dopa/多巴胺指数，L在HFDL减弱二者；CL较C进一步降低SBP。UACR和ClCr无组间差异。HFD降低利尿、FENa⁺和UNa⁺.V，L在HFDL预防这些效应。组织学与超微结构方面，苏木精–伊红染色显示HFD皮质小管细胞出现胞质空泡，CL与C无变化，HFDL空泡较HFD小；透射电镜显示HFD足细胞足突缩短和融合，L在HFDL预防，CL与C无差异；这些为早期局灶改变的定性和描述性发现。肾脏多巴胺能系统、RAS蛋白表达与Na⁺/K⁺-ATPase方面，Western blot显示LAT2和OCT2无组间变化；HFD较C降低OCTN_1,2,3，L预防该降低；L预防HFDL较HFD的D₁DR过表达；D₂DR在CL较HFDL增加；HFD过表达AT₁R，L未改变；HFD增加Na⁺/K⁺-ATPase表达，L在HFDL较HFD预防该增加。相关性方面，L-Dopa/多巴胺指数与SBP、胰岛素和D₁DR正相关，与UNa⁺.V及OCTN_1,2,3负相关，L在HFDL预防这些改变。炎症标志物与间质纤维化方面，HFD显著增加NF-κB₁和TGF-β₁表达，L在HFDL预防；L本身在CL较C降低TGF-β₁。HFD较C增加间质纤维化，L在HFDL较HFD显著降低，CL较C无变化；半定量结果为C = 15.25 ± 1.92，HFD = 28.98 ± 3.75，CL = 20.45 ± 3.21，HFDL = 20.37 ± 3.09。

讨论总结：研究人员认为，不健康习惯组合可促发高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、SBP升高和全身炎症等代谢改变。HFD组体重显著增加，L可有效预防；尽管HFD组食物摄入较低，但饮食热量密度较高使热量摄入约高33%，解释体重增加。水摄入无差异，且迄今无证据表明氯沙坦影响该参数。方法学考虑是体重可能对肾脏和代谢结果产生混杂效应；由于L完全预防HFD诱导的体重增加，HFDL中结构和功能肾保护可能继发于脂肪量减少或全身代谢状态改变，而非直接肾内AT₁R/RDS相互作用。但数据揭示全身代谢紊乱与局部肾脏保护分离：HFDL大鼠尽管体重较低，空腹血糖、TyG指数和HOMA-IR与HFD组无统计学差异，表明胰岛素抵抗和代谢功能障碍持续存在。L在肾脏的作用具有选择性，恢复OCTN_1,2,3表达并正常化D₁DR和Na⁺/K⁺-ATPase水平，而未改变HFD诱导的AT₁R过表达，提示肾脏结构、足细胞超微结构和尿钠排泄能力的保留似乎主要由直接AT₁R阻断和局部AT₁R-D₁DR负交互破坏驱动。代谢方面，HFD诱导胰岛素抵抗，L部分减弱甘油三酯和胰岛素增加，未改变葡萄糖或TyG和HOMA-IR；CL与C无差异。可能机制与SOD激活减少氧化应激有关，但确切机制仍不确定。血流动力学方面，HFD增加SBP，与RAS激活、Ang II和醛固酮升高、AT₁R上调和肾脏炎症及纤维化一致；L预防SBP增加，并可降低正常血压对照大鼠SBP。肾滤过方面，ClCr在所有组保持正常，L未改变ClCr；但OCTN_1,2,3失调可能影响肾小管肌酐分泌基线动力学，限制ClCr作为肾小球滤过率估计值的解释。UACR在所有组低于30 mg/g。HFD降低利尿，L预防；FENa⁺和UNa⁺.V在HFD降低，L部分预防，提示Na⁺/K⁺-ATPase非依赖性钠重吸收机制可能仍活跃。组织学空泡可能由脂滴或水样变性导致，与脂毒性相关Na⁺/K⁺-ATPase功能障碍有关，L通过减少炎症和氧化应激减轻该改变。透射电镜足突改变与Ang II通过AT₁R介导损伤及肾脏多巴胺保护作用一致。HFD诱导MS样表型与RAS激活及Ang II作用于AT₁R刺激Na⁺/K⁺-ATPase促钠潴留相关；HFD抑制RDS活性，增加抗尿钠排泄。AT₁R与D₁DR在近端小管细胞存在负相关，激活一个受体诱导另一个受体内化和信号丢失，以Na⁺/K⁺-ATPase为共同靶点。HFD增加肾脏AT₁R表达，L 8周未预防AT₁R过表达，但有下降趋势，提示更长治疗可能必要。L预防尿L-Dopa/多巴胺指数增加，提示更大管状多巴胺可用性和尿排泄，与恢复OCTN_1,2,3相关；LAT2和OCT2不变，与果糖过载模型不同。HFD增加D₁DR表达，L预防；D₂DR表达降低且不受L影响，反映饮食诱导肾脏多巴胺能信号破坏。D₁DR和D₂DR是肾皮质中最丰富且活性强的亚型，分别介导多巴胺的肾脏血流动力学/尿钠排泄和细胞/抗炎作用。皮质Na⁺/K⁺-ATPase表达被HFD增加，L预防而不改变基线表达，与AT₁R-D₁DR变构交互一致。尿L-dopa/多巴胺指数与SBP和胰岛素正相关，与UNa⁺.V和OCTN_1,2,3负相关，提示尿儿茶酚胺处理与血压、钠平衡和胰岛素抵抗相关；在L治疗动物中这些关联不再观察到，并与AT₁R阻断和Na⁺/K⁺-ATPase表达降低平行。炎症方面，RDS发挥抗炎作用，RAS促进炎症；肾脏多巴胺通过D₁DR和D₂DR信号可减少炎症和纤维化，减弱Ang II效应。HFD诱导促炎环境，NF-κB₁和TGF-β₁过表达、间质纤维化增加和氧化通路激活，L降低纤维化和氧化应激。研究局限性包括：8周治疗期可能较短；样本量较小，尤其C和CL组；仅纳入雄性大鼠；未直接评估多巴胺合成和/或下游信号及AT₁R信号；群养导致饮水给药剂量可能变异；饮食其他成分差异不能完全排除；尾套法测SBP存在局限；ClCr作为肾滤过指标有局限；仅评估Na⁺/K⁺-ATPase蛋白表达，未区分磷酸化和非磷酸化形式，也未测定活性；未直接评估氧化应激。

研究结论翻译：总之，在HFD诱导的MS样表型中，早期给予氯沙坦与HFD诱导的功能性、结构性和超微结构肾脏改变的减轻以及多个参数的预防相关。这些效应伴随RDS和RAS相关参数的变化，与这两个系统之间平衡的部分恢复一致。总体而言，这些发现提示早期氯沙坦治疗在该实验模型中具有潜在肾保护作用。