《Cell》：Rare k-mers reveal centromere haplogroups underlying human diversity and cancer translocations
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人类着丝粒高度可变，但其重复性结构阻碍了针对群体多样性与疾病相关性的常规分析，使得着丝粒仍属于基因组中注释程度最低的区域之一。研究人员发现，着丝粒区域中的稀有k-mer（rare k-mers）能够捕获谱系特异性变异，从而定义具有不同结构特征的离散单倍群。研究
人类着丝粒高度可变，但其重复性结构阻碍了针对群体多样性与疾病相关性的常规分析，使得着丝粒仍属于基因组中注释程度最低的区域之一。研究人员发现，着丝粒区域中的稀有k-mer（rare k-mers）能够捕获谱系特异性变异，从而定义具有不同结构特征的离散单倍群。研究人员开发了ascairn，用于从短读长全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）数据中推断这些单倍群。将该框架应用于超过3,300例基因组，揭示了着丝粒单倍群广泛的全球多样性以及种群历史的特征。研究人员分析了142例伴有1p/19q共缺失的少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma, ODG）病例的短读长WGS数据，将断点定位至1号和19号染色体的着丝粒区域，揭示了断点与动粒附着位点之间清晰的位置关系，并建立了着丝粒单倍型结构与重排易感性之间的联系。因此，稀有k-mer为着丝粒的群体规模分析打开了大门，将着丝粒结构多样性与人类进化历史及疾病相关的基因组不稳定性联系起来。
人类着丝粒是基因组中高度可变但研究最为薄弱的区域之一。其主要由α-卫星DNA组成，包含约171 bp的单体单元，串联重复形成高阶重复序列（higher-order repeat, HOR）阵列；其中与着丝粒蛋白A（CENP-A）相关的“活性”α-卫星HOR阵列（active α-satellite HOR arrays, aHOR arrays）承载动粒附着位点，在着丝粒功能中发挥关键作用，并涉及癌症中常见的着丝粒易位和非整倍体。然而，由于这些区域的高度重复性，短读长测序平台长期无法有效解析着丝粒，使其成为基因组科学中的“暗物质”区域。尽管近年来长读长测序技术的进步已能够重建包含着丝粒的完整人类基因组，但高覆盖长读长测序的时间和成本仍阻碍着人群规模的着丝粒研究，临床样本也因需要高分子量DNA而难以大规模分析。因此，迫切需要一种能够利用常规短读长全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）数据进行着丝粒群体多样性和疾病相关性分析的新方法。
研究人员提出利用稀有k-mer作为新的多态性标记，以解析人类着丝粒结构复杂性。他们从118个个体的染色体规模单倍型装配中提取了活性α-卫星HOR单倍型（aHOR-haplotypes, aHOR-haps），构建了参考aHOR-hap面板；基于稀有k-mer的分布特征，通过层次聚类将每条染色体上的aHOR-haps分为3至16个单倍群（aHOR-HGs）。在此基础上，研究人员开发了概率框架ascairn，该框架能够从个体的短读长WGS数据中推断最可能的aHOR-HG组合和aHOR-hap对，并以参考面板中最接近的单倍型作为代理序列。研究人员将ascairn应用于1000 Genomes计划（n=2,504）和人类基因组多样性计划（Human Genome Diversity Project, HGDP；n=828）的短读长WGS数据，揭示了着丝粒单倍群在全球人群中的广泛多样性和显著的人群特异性分布，并显示出与“走出非洲”模型一致的进化痕迹。此外，研究人员分析了The Cancer Genome Atlas（TCGA）中142例IDH突变型少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma, ODG）的1p/19q共缺失病例，将重排断点定位至1号染色体D1Z7和19号染色体D19Z3活性aHOR阵列内部，发现断点位置与着丝粒凹陷区（centromere dip region, CDR）所代表的动粒附着位点存在明确的位置关系，并进一步证明aHOR单倍群通过影响断点易感区域（breakpoint-susceptible region, BSR）的大小来调节重排易感性。该研究首次将稀有k-mer应用于着丝粒单倍群分类，使着丝粒能够进行群体规模分析，为理解着丝粒结构多样性在人类进化史和癌症相关基因组不稳定性中的作用提供了新框架。论文发表在《Cell》。
研究人员在开展研究时使用了以下主要关键技术方法：首先，从多个公开计划（包括人类泛基因组参考联盟[HPRC]、人类基因组结构变异联盟[HGSVC]、T2T联盟）的118个个体染色体规模组装中提取aHOR-hap序列，并利用NucFlag进行质量过滤；其次，定义每条染色体上出现频率极低的27bp稀有k-mer集合，去除多重比对和错误信号；第三，基于稀有k-mer存在/缺失谱进行层次聚类（Ward法）确定aHOR-HG；第四，开发ascairn概率模型，采用负二项分布和两步骤生成模型，从短读长WGS数据推断单倍群和单倍型对；第五，通过逐个体交叉验证、父母-子三重奏孟德尔一致性检验评估推断准确性；第六，利用等位基因特异性稀有k-mer的拷贝数变化分析肿瘤断点；第七，使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）和Pacific Biosciences（PacBio）高保真（HiFi）长读长测序及Hi-C对两个手术标本进行直接验证；第八，通过CENP-A染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和DNA甲基化分析定位CDR和功能着丝粒活性。
**Clustering aHOR-haps by rare k-mers（基于稀有k-mer对aHOR-haps进行分群）**：研究人员从参考aHOR-hap面板中提取稀有k-mer，发现非洲人群aHOR阵列中稀有k-mer数量显著高于其他人群，且阵列内部稀有k-mer多数频率较低，侧翼区域则存在古老的高频变异。层次聚类将各染色体aHOR-haps分为多个aHOR-HG，并发现与已知结构变异（如1号染色体D1Z7大片段倒位、19号染色体D19Z3失活α-卫星HOR插入）共分离，表明稀有k-mer谱能够有效捕获着丝粒结构谱系。
**Haplogroup typing using short-read sequencing（利用短读长测序进行单倍群分型）**：研究人员开发了ascairn，并通过逐个体交叉验证显示，aHOR-HG对分配的准确率在各染色体间为80.7%–100%（中位数92.7%），即使在5×和1×低覆盖度下仍保持约90%和86%的中位准确率。在519个三重奏中，孟德尔一致性达97.7%，证实了该方法在独立样本中的可靠性。
**aHOR-HG variations in large human populations（大范围人群中的aHOR-HG变异）**：研究人员将ascairn应用于1000 Genomes和HGDP数据，发现许多aHOR-HG具有显著的人群特异性。非洲人群独有大量单倍群，而非非洲人群共享的单倍群在非洲频率较低，符合“走出非洲”模型。以D1Z7倒位相关单倍群为例，C1-aHOR-HG 10几乎仅存在于非洲，而C1-aHOR-HG 8和9在欧洲和南亚人群中分别占优；D19Z3插入相关单倍群中，C19-aHOR-HG 2在中南美洲和东亚人群频率高，C19-aHOR-HG 3几乎仅见于非洲。这些结果说明着丝粒单倍群保留了人类迁徙历史的清晰印记。
**Analysis of 1p/19q co-deletions in gliomas（胶质瘤中1p/19q共缺失分析）**：研究人员对TCGA 142例ODG的肿瘤和匹配正常样本WGS数据进行分析，通过ascairn推断患者D1Z7和D19Z3的单倍群及代理单倍型，并利用等位基因特异性稀有k-mer的拷贝数变化定位断点。结果表明所有可评估病例的断点均位于D1Z7和D19Z3活性aHOR内部，且断点在D1Z7中主要位于CDR的p臂侧（90/103），在D19Z3中主要位于CDR的q臂侧（87/119），支持1p/19q共缺失通过同源重组产生两个衍生染色体、随后丢失无着丝粒片段的模型。
**Validation of breakpoint location using long-read sequencing（利用长读长测序验证断点位置）**：研究人员对两个手术标本（ODG-001和ODG-002）进行ONT、PacBio HiFi及Hi-C测序，并利用hifiasm进行二倍体组装。通过比对肿瘤和正常读段，在单核苷酸分辨率下确认了断点位于D1Z7和D19Z3活性aHOR内，且重排产生典型的约171 bp融合单体（ODG-001）或非典型261 bp融合单体（ODG-002）。CENP-A ChIP-seq显示两个肿瘤样本中D1Z7来源的着丝粒区域为主要CENP-A富集区，提示该区域在肿瘤中优先具活性。
**Impact of centromere haplotypes on translocation（着丝粒单倍型对易位的影响）**：研究人员定义BSR为从CDR向丢失臂方向延伸的区域（D1Z7的p臂侧和D19Z3的q臂侧），发现BSR大小在不同aHOR-HG间存在显著差异。通过比较同一患者中两个亲本等位基因，较大BSR的等位基因显著更易发生重排（D1Z7 p=0.0018；D19Z3 p=4×10
-4）。基于Bradley-Terry模型的估计显示，各aHOR-HG的重排易感性与平均BSR大小显著相关，其中C19-aHOR-HG 13因CDR强烈偏向q臂、BSR极短而表现出极低的重排倾向。
讨论部分指出，稀有k-mer作为完全非比对方法的标记，首次使得从短读长测序数据中直接推断着丝粒单倍群成为可能，将着丝粒分析开放给群体规模研究。aHOR-HG类似于线粒体和Y染色体单倍群，能够反映谱系结构，并且与既往基于侧翼区域推断的研究相比，具有更高的分辨率和序列解析度。关于der(1;19)易位，研究证明其保留了正常亲本染色体1和19的动粒附着位点区域；CENP-A ChIP-seq显示D1Z7来源区域优先活跃，但样本量有限，仍需进一步验证。研究还首次提供了aHOR阵列结构多态性可调节疾病特异性着丝粒异常易感性的证据，并可能类似于减数分裂中的“着丝粒驱动”机制。局限性包括参考面板规模有限、同单倍群内等位基因区分困难、以及当前模型对核型异常样本的适用性限制，但这些将随着长读长测序数据的增加而改善。
研究结论：稀有k-mer将着丝粒开放至群体规模分析，将着丝粒结构多样性与人类进化历史及疾病相关的基因组不稳定性联系起来。
