基于噬菌体展示技术靶向纤连蛋白的兔源scFv抗体的构建与表征

《International Journal of Molecular Sciences》：Construction and Characterization of Rabbit scFv Antibodies Targeting Fibronectin by Phage Display Technology

　　

纤连蛋白（Fibronectin, FN）是一种多功能糖蛋白，参与细胞外基质重塑、肿瘤进展、组织修复和宿主-病原体相互作用。尽管其具有生物学和临床相关性，但源自非啮齿类动物的FN结合抗体仍相对较少被探索。在本研究中，研究人员用全长重组人FN免疫一只家兔，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（Western blotting）证实了其产生了强烈的抗体应答。研究人员从外周血单个核细胞构建了两个兔源单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）噬菌体展示文库，短连接肽和长连接肽形式的转化子分别达到5.5×107和5.0×107。经过四轮生物淘选，噬菌体ELISA证实了富集效果，序列分析将所选克隆分为五个短连接肽组和四个长连接肽组。七个纯化的scFv显示出不同的ELISA结合谱。基于光纤粒子等离子体共振（FOPPR）的动力学分析得出的表观平衡解离常数（KD,app）范围为11.21–432.06 nM，其中FN-L13的KD,app最低。分析型尺寸排阻色谱显示这些scFv主要为单体形式。五个scFv通过蛋白质印迹法可识别小鼠血浆中与纤连蛋白一致的高分子量条带。ELISA结果显示这些scFv优先结合FN，对人血清白蛋白（HSA）以及胶原蛋白I、III和IV的反应性普遍较低，但FN-S1和FN-L1对纤维蛋白原表现出可检测的反应性。这些发现支持了兔源FN结合scFv可作为未来FN相关检测方法开发和机制研究的科研试剂。

论文解读

研究背景、现存问题与研究意义

纤连蛋白（Fibronectin, FN）是一种大型多功能糖蛋白，作为细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的主要成分，在维持组织架构、调控细胞黏附、迁移、增殖、分化、存活以及血管生成、组织修复和癌症转移等过程中发挥关键作用。FN基因的选择性剪接产生多种亚型，其在发育和组织重塑中表达受到严格调控，但在炎症、纤维化和肿瘤进展等病理条件下表达常显著升高。此外，FN还被认为是一种重要的宿主因子，可被金黄色葡萄球菌等多种细菌病原体利用作为桥连分子，促进其与宿主细胞的黏附和侵袭。鉴于FN在癌症、组织重塑和宿主-病原体相互作用中的核心地位，开发高亲和力、高特异性的FN结合抗体对于相关基础研究和诊断应用具有重要意义。然而，目前针对FN的抗体多来源于啮齿类动物，而兔源抗体因其独特的抗体库多样化机制（涉及体细胞高频突变和基因转换），能够识别保守或弱免疫原性抗原，并产生多样化的表位识别和优良的结合特性。传统兔多克隆抗体存在批次间差异和依赖持续免疫等问题，而重组单克隆抗体如单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）则具有分子量小、易于细菌表达和兼容分子工程改造的优势。因此，本研究旨在整合兔免疫与噬菌体展示技术，构建兔源scFv文库，筛选并表征一组针对重组人FN的scFv抗体，为后续FN相关的检测方法开发和机制研究提供新的重组工具。

主要关键技术方法

研究人员首先使用重组人FN蛋白免疫一只新西兰白兔，并通过ELISA和蛋白质印迹法确认其产生了强烈的体液免疫应答。随后，从免疫兔的外周血单个核细胞（PBMCs）中提取总RNA，逆转录为cDNA，并以此为模板通过PCR扩增抗体轻链可变区（V_L）和重链可变区（V_H）基因。通过重叠延伸PCR，分别使用短连接肽（GGSSRSS）和长连接肽（SSGGGGSGGGGGGSSRSS）将V_L和V_H组装成完整的scFv基因，并将其克隆至pComb3X噬菌粒载体中，构建两个兔源scFv噬菌体展示文库。通过四轮针对FN的生物淘选（biopanning）富集特异性结合克隆，并对阳性克隆进行测序分类、诱导表达和Ni²⁺亲和层析纯化。采用ELISA、蛋白质印迹法、光纤粒子等离子体共振（FOPPR）生物传感器和分析型尺寸排阻色谱（SEC）对纯化scFv的结合活性、动力学参数、寡聚状态及交叉反应性进行了系统表征。

研究结果

2.1 兔免疫及免疫应答分析：重组FN蛋白免疫后，ELISA结果显示免疫后血清即使在1:128,000稀释度下仍保持强FN结合活性（OD₄₅₀ > 1.0），终点滴度大于1:128,000，且蛋白质印迹法也证实了强烈的FN结合信号，表明成功诱导了强烈的抗体应答。

2.2 兔scFv文库的构建：从免疫兔PBMCs成功构建了两个scFv噬菌体展示文库，短连接肽和长连接肽文库的转化子数量分别为5.5×10⁷和5.0×10⁷，菌落PCR验证随机挑选的克隆均含有预期大小的插入片段。

2.3 通过生物淘选筛选FN结合scFv抗体：经过四轮生物淘选，洗脱噬菌体的滴度从约10⁴ CFU逐步增加至接近10⁶ CFU，噬菌体ELISA也证实了FN结合克隆的渐进式富集。

2.4 选定scFv抗体的蛋白表达与结合试验：从每轮文库中各随机选取13个克隆进行诱导表达，蛋白质印迹法证实除长连接肽文库的3号克隆外，其余克隆均表达了预期分子量（25-37 kDa）的scFv。ELISA检测显示，除FN-S3外，所有可评估的克隆均表现出对FN的可检测结合活性。

2.5 选定scFv抗体的序列分析与分类：测序分析将短连接肽文库的13个克隆归为5个独特序列组（FN-S1, -S3, -S4, -S6, -S8），长连接肽文库的13个克隆归为4个组（FN-L1, -L3, -L5, -L13）。氨基酸序列比对显示，互补决定区（CDRs）的种系分歧度普遍高于框架区（FRs），尤其在V_H结构域更为显著。

2.6 选定兔scFv抗体的结合活性测定：纯化了7个scFv（排除不结合的FN-S3和含提前终止密码子的FN-L3），SDS-PAGE显示分子量约27 kDa。ELISA滴定实验显示不同克隆结合活性存在差异，其中FN-L1活性最强。FOPPR动力学分析得出这些scFv的表观平衡解离常数（K_D,app）范围为11.21至432.06 nM，FN-L13和FN-S4表现出最低的K_D,app值（分别为11.21和15.45 nM）。初步的顺序结合竞争分析提示这7个克隆可能识别FN上相同或高度重叠的表位。分析型SEC结果表明纯化的scFv主要以单体形式存在。

2.7 兔scFv抗体对FN和小鼠血浆的蛋白质印迹分析：在蛋白质印迹实验中，7个纯化scFv中有5个（FN-S1, FN-S6, FN-L1, FN-L5, FN-L13）能检测到小鼠血浆中与FN一致的条带，但信号强度各异，而FN-S4和FN-S8未显示反应性。

2.8 兔scFv抗体对选定ECM相关及血浆蛋白的结合选择性与交叉反应性分析：ELISA结果显示所有7个scFv均优先结合FN，对HSA、BSA及测试的胶原蛋白反应性普遍较低，但FN-S1和FN-L1对纤维蛋白原显示出可检测的反应性。蛋白质印迹结果进一步显示，FN-S8和FN-L5与胶原蛋白IV制备物中一个约50-60 kDa的物种有反应。

讨论总结与研究结论翻译

讨论总结：本研究成功利用兔免疫和噬菌体展示技术，从单个免疫兔中快速获得了针对重组人FN的scFv抗体。尽管人FN与预测的兔FN序列高度相似，但仍引发了强烈的免疫应答，证实了兔在针对保守抗原的抗体发现中的价值。所构建文库经四轮淘选即富集到多个功能性克隆，体现了免疫库策略的效率。序列分析揭示了广泛的体细胞多样性，不仅限于CDR区域，也包括框架区。FOPPR动力学分析表明这些scFv具有纳摩尔至亚微摩尔的表观亲和力，其中FN-L13亲和力最高。初步的表位竞争实验提示所有克隆可能识别相同或紧密重叠的表位，这可能限制了它们在夹心免疫分析中作为配对试剂的直接应用。对小鼠血浆的反应性表明部分scFv具有跨物种识别能力，而对其他ECM和血浆蛋白的交叉反应性分析显示了克隆依赖性和检测方法依赖性的差异。这些scFv可作为研究FN介导的宿主-病原体相互作用的潜在功能工具。

研究结论翻译：总之，本研究生成并表征了一组靶向重组人FN的兔源scFv抗体。基于FOPPR的动力学分析得到的K_D,app值范围为11.2至432 nM，其中FN-L13显示出最低的11.2 nM。分析型SEC表明纯化的scFv主要为单体，伴有少量高分子量物种。五个构建体在蛋白质印迹条件下显示出对小鼠血浆中与FN一致的高分子量条带的反应性，而交叉反应性分析显示总体上优先结合FN，但存在克隆依赖性和检测方法依赖性的脱靶反应性。在使用人源样本、更广泛的特异性分析和正交结合方法进行进一步验证之前，尚无法确定其分析效用。尽管如此，这些scFv为未来的检测方法开发和机制研究（包括FN相关宿主-病原体相互作用的研究）提供了重组的FN结合试剂。