《Biology》：DNA-Encoded Binding Affinity Shapes Robust CTCF Occupancy Across Cellular Contexts
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CCCTC结合因子（CTCF）是一种架构蛋白，通过结合典型人类细胞类型中数万个基因组位点来组织三维（3D）基因组架构。尽管DNA结合亲和力有助于体内CTCF占位，但区分稳健占位与情境依赖性占位的原则仍不完全清楚。在此，研究人员将CTCF-DNA结合亲和力的定量
CCCTC结合因子（CTCF）是一种架构蛋白，通过结合典型人类细胞类型中数万个基因组位点来组织三维（3D）基因组架构。尽管DNA结合亲和力有助于体内CTCF占位，但区分稳健占位与情境依赖性占位的原则仍不完全清楚。在此，研究人员将CTCF-DNA结合亲和力的定量测量与全基因组占位谱整合。利用具有限定亲和力水平的合成串联CTCF位点阵列，研究人员实验检验了DNA编码的亲和力是否在体内建立可预测的CTCF占位层级。研究人员识别出两个CTCF-DNA结合亲和力阈值，界定三种不同的CTCF占位状态。高亲和力位点在多种细胞环境和染色质环境中更频繁且一致地被占位，而中等和低亲和力位点表现出更强的情境依赖性。合成阵列进一步揭示了一个可重复的占位层级，该层级在不同基序排列中得以维持。高亲和力位点优先与强染色质环和拓扑关联结构域（TAD）边界相关，并且贡献结合亲和力的侧翼CTCF基序在强环锚点富集。总之，这些发现建立了一个定量框架，其中CTCF-DNA结合亲和力将序列编码的结合特性与CTCF占位的稳健性和情境依赖性以及CTCF介导的三维基因组组织特征联系起来。
研究背景：人类基因组三维（3D）组织对基因调控、细胞身份维持和细胞功能至关重要。其核心机制之一是黏连蛋白（cohesin）驱动的环挤出，CTCF（CCCTC结合因子，一种序列特异性DNA结合架构蛋白）与cohesin协作，作为方向性屏障决定环挤出停止位置，参与染色质环和拓扑关联结构域（TAD）边界形成。CTCF对发育和细胞功能重要，可识别超过110,000个人基因组位点，但这些位点在不同细胞情境中占位模式不同：部分跨组织一致占位，部分显著情境依赖。既往定量测量约270,000个人基因组序列的CTCF-DNA亲和力，发现其与多种人体组织和细胞系体内CTCF占位中度相关（Spearman’s ρ为0.43至0.62），但不清楚DNA编码亲和力是仅沿连续谱决定占位概率，还是定义不同占位稳健性区间。因此，研究人员开展本研究，以解析亲和力是否以及如何影响体内CTCF占位稳健性，并连接序列编码信息与三维基因组组织。
关键技术方法概述：研究人员整合MpEMSA-seq测定的CTCF-DNA结合亲和力与61个ENCODE组织/细胞环境CTCF ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）占位谱，并以25个非冗余细胞类型独立验证；采用SSlogis（self-starting logistic，自启动逻辑函数）非线性回归及导数确定阈值，用bootstrap和敏感性分析评估稳健性；利用A/B区室、亚区室、CTCF ChIA-PET、Hi-C和已发表TAD边界注释分析三维组织；在HEK293T细胞中构建含三个串联CTCF位点的慢病毒报告系统，以ChIP-qPCR定量相对占位。数据来源包括Zenodo、ENCODE、UCSC及已发表注释。
3.1 两个亲和力阈值界定三种CTCF占位状态：研究人员将118,395个CTCF识别序列按亲和力分为12个区间，前11个区间各含10,000个序列。最高亲和力区间中51.2%的位点在61个组织/细胞环境中均被占位，75%在至少93%环境中被占位；最低亲和力区间中超过75%的位点在少于20%环境中被占位。对120个子集进行SSlogis拟合及导数分析，得到上阈值4.07、下阈值2.25，中间过渡点3.10。Bootstrap分析得两个过渡点95%置信区间分别为4.02–4.12和2.22–2.28；改变分箱数、采用free-floor模型、按原始值排序及限制33个含60,000–80,000个CTCF位点的环境后，阈值总体一致。25个非冗余细胞类型得4.29、1.90和2.97。上述阈值限于MpEMSA-seq亲和力标度，并据此定义高亲和力（>4.07）、中等亲和力（>2.25且≤4.07）和低亲和力（≤2.25）三种占位状态。
3.2 CTCF-DNA结合亲和力塑造跨细胞类型稳健占位：在K562细胞中，44,155个CTCF占位位点含44.4%高亲和力、31.5%中等亲和力和24.1%低亲和力位点；而在71,915个未检测到占位的CTCF识别序列中，仅3.7%为高亲和力、15.6%为中等、80.7%为低亲和力。高亲和力位点88.1%被占位，中等为55.4%，低仅15.5%；高亲和力位点不仅占位频率高，整体占位信号也更强。A区室中低亲和力占位8753个，B区室中1871个；但高亲和力位点在A和B区室中均显示最强CTCF占位，A区室整体信号更高。在八个亚区室中，K562低亲和力占位从A1至B4逐渐减少，高和中等亲和力位点在A1-A3较相似，随后向抑制性亚区室总体下降。HUVEC、GM12878及单倍体HAP1细胞中观察到相同总体关系。
3.3 染色质区室状态差异与低亲和力CTCF位点占位变化相关：ROR1启动子及周边区域在HUVEC中为A区室、在K562中为B区室，其中亲和力0.92的低亲和力CTCF位点仅在HUVEC中占位；ANK3启动子区域呈相反转变，三个低亲和力位点（0.96、0.73、2.03）仅在K562中占位。chr3上A-to-B转变区域中四个中等或低亲和力位点占位明显降低，chr1上B-to-A转变区域中中等和低亲和力位点占位显著增加；高亲和力位点如ROR1上游亲和力4.35位点在两种细胞中占位相当。低亲和力位点位于H3K27ac活性调控元件的比例比高亲和力位点至少高3.4倍。系统分析显示，HUVEC-K562 A-to-B转变后，高亲和力位点占位数仅降7.5%，中等降28.8%，低降61.5%；B-to-A转变后，高仅增9.8%，中等增30.7%，低增35.2%。GM12878-K562、HUVEC-GM12878和HAP1-K562比较中趋势相似。
3.4 受试高亲和力位点比低亲和力位点显示更稳健CTCF占位：研究人员在HEK293T细胞中构建慢病毒报告系统，将三个CTCF识别序列串联排列，相邻位点间约700 bp，并以hPGK驱动Puro-T2A-ZsGreen1表达盒进行选择和识别。选取亲和力5.69、3.37和0.87分别代表高、中、低亲和力，所有序列均无CG二核苷酸。三个序列测试六种排列，并设H-H-H对照；另设固定正、负对照基因组位点。负对照信号低，正对照占位强，H-H-H三个位置均高占位。六种排列中高亲和力序列始终占位最强，中、低亲和力序列占位明显较弱，部分配置接近负对照。该实验支持DNA编码亲和力是体内稳健CTCF占位的重要决定因素。
3.5 高亲和力CTCF位点优先参与染色质环并富集于TAD边界：基于K562 CTCF ChIA-PET数据，定义强染色质环为loop score≥500且锚点具有汇聚CTCF基序者（n=3718），高亲和力位点参与频率比中等和低亲和力位点分别高47%和85%。基于5 kb分辨率Hi-C定义强环为强度前20%者（n=668），高亲和力位点参与频率比中等和低分别高33%和70%。限制至276个两个锚点CTCF ChIP-seq相对信号均为60至90的强ChIA-PET环后，高亲和力位点仍比中等和低高19%和66%。在IMR90细胞中，TAD边界周围25 kb区域内，高亲和力占位位点富集28.5%（O/E=1.285），中等富集8.2%（O/E=1.082），低亲和力位点耗竭13.6%（O/E=0.864）。
3.6 侧翼CTCF基序与稳健CTCF占位和强染色质环相关：既往显示Motif-2、-2′和-3等侧翼基序可影响CTCF-DNA结合亲和力。研究人员按Motif-1及侧翼基序组合将识别序列分为1+2+3、1+2′+3、1+2、1+2′、1+3和仅Motif-1六类。高亲和力位点中含两个侧翼基序的配置比例比中、低亲和力位点高逾1.9倍；含单个上游Motif-2或Motif-2′的比例高逾29%；仅含核心Motif-1者在低亲和力位点占54.2%，在高亲和力位点仅35.0%。占位分析显示含两个侧翼基序者总体占位最高，仅核心Motif-1者最低。强ChIA-PET环锚点中，两个侧翼基序最高，一个侧翼基序平均降低19.6%，仅核心降低33.8%；Hi-C环中分别降低15.4%和26.2%。
讨论部分总结：本研究的中心发现是，CTCF-DNA结合亲和力与体内CTCF占位并非简单连续概率关系，而是由两个亲和力阈值界定三种占位状态。去除重复和相关组织样本后，25个非冗余细胞类型中高亲和力阈值从4.07轻度升至4.29，但高亲和力位点仍一致高占位。A/B区室转换时，中等和低亲和力位点占位变化大，高亲和力位点相对不敏感，说明染色质环境影响并非对所有CTCF位点等效。合成阵列实验在共同实验背景中比较限定亲和力类别，部分解耦DNA序列与染色质环境变量，支持DNA编码亲和力贡献占位层级；但慢病毒整合并非完全随机，且合成阵列不能完全复现内源染色质复杂性，因此不能认为DNA亲和力完全决定CTCF占位。与既往研究一致，高亲和力位点更持久并优先参与高级染色质结构，低亲和力位点更富集于增强子和启动子。研究人员使用MpEMSA-seq实验测定亲和力，而非以CTCF耗竭敏感性或基序相似性替代，建立了实验亲和力与占位稳健性之间的定量联系。高亲和力位点优先出现在强环锚点和TAD边界，低亲和力位点对区室转换更敏感，可能提供更情境响应的CTCF占位和三维基因组相互作用层。CpG甲基化可降低CTCF-DNA结合强度，可能通过将位点推过亲和力阈值影响占位。疾病相关非编码变异也可能无需完全破坏结合，只需降低亲和力跨阈值即可显著改变占位。侧翼序列可影响亲和力并优先出现在强环锚点。局限包括阈值非通用、合成阵列不能完全复刻内源环境、关联性结果不能证明因果。未来需结合甲基化、疾病变异、侧翼基序扰动及内源位点直接改变亲和力，检验CTCF亲和力对占位和环稳定性的因果影响。结论翻译：总之，研究人员的发现建立了CTCF-DNA结合亲和力与多种细胞环境中体内CTCF占位之间的定量关系。除影响CTCF占位概率外，DNA编码结合亲和力将CTCF位点分成对染色质环境敏感性不同的不同状态。高亲和力位点在细胞环境中更一致占位，对染色质变异不敏感，并优先与强染色质环和TAD边界相关。相反，中等和低亲和力位点表现出更强情境依赖性，可能提供更灵活的CTCF占位和染色质相互作用层。研究人员进一步表明，贡献总CTCF-DNA结合亲和力的CTCF侧翼基序优先出现在强染色质环锚点。总之，这些发现将DNA编码结合亲和力确立为理解体内CTCF占位稳健性和情境依赖性的定量框架，并提示CTCF-DNA结合亲和力的定量变异可能有助于平衡CTCF占位和三维基因组组织的稳健与情境响应特征。
