人类器官芯片模型重现了 FRC 驱动的高内皮微静脉分化、免疫募集及癌症诱导的破坏

《Cell Reports》：Human organ chip models recapitulate FRC-driven high endothelial venule differentiation, immune recruitment, and cancer-induced disruption

要点

• 人源器官芯片模型再现了基质对高内皮微静脉（HEV）特化的调控
• 成纤维网状细胞（FRCs）诱导工程化血管表达HEV标志物
• HEV芯片显示T细胞与血管腔面的黏附增强
• 乳腺癌细胞的存在破坏了HEV表型与完整性

摘要

高内皮微静脉（High Endothelial Venules, HEVs）是一种特化的后毛细血管静脉，负责淋巴细胞进入淋巴结的门控，然而能够捕获其特化特征的体外人源模型仍然有限。在本研究中，我们开发了一种可灌注的人源HEV芯片（HEV-on-chip），在该芯片中，血内皮细胞（BECs）在含有成纤维网状细胞（FRCs）的胶原蛋白-纤维蛋白基质中形成工程化微血管。FRCs的存在（无需外源性LIGHT）即可驱动HEV相关标志物（PNAd/MECA-79和VCAM-1）的表达，并形成由增厚的层粘连蛋白阳性基底膜包裹的饱满内皮壁，再现了淋巴结HEVs的特征。在功能层面，类HEV血管支持显著增强的T淋巴细胞黏附，同时保持VE-钙黏蛋白连接。在相邻通道中引入MDA-MB-231乳腺癌细胞后，MECA-79表达降低，连接组织受到破坏，通透性增加，但未诱导凋亡。总体而言，该平台定义了人源HEV身份的基质指令程序，并建立了一个可操作的癌症相关HEV功能障碍模型。

图形摘要

引言

高内皮微静脉（HEVs）是一种特化的后毛细血管血管，作为淋巴细胞从血液进入次级淋巴器官的门户。HEV通过独特的结构和分子适应机制，实现了天然淋巴细胞的 efficient 募集，并维持免疫监视和适应性免疫应答。HEVs在淋巴结（LNs）中最为突出，其战略性地位于副皮质区和滤泡间区域，以支持T细胞启动和抗原驱动的免疫激活。HEVs嵌入由成纤维网状细胞（FRCs）构成的致密基质网络中，这些细胞在整个T细胞区形成三维网状结构。FRCs既提供机械支撑，又提供调节免疫细胞转运、存活和定位的生物化学信号。血管周FRC亚群与淋巴结血管（包括HEVs）紧密关联，在这些血管周围形成特化鞘层，促进淋巴细胞从血管腔内迁移至淋巴结实质。在这一结构中，HEVs代表一个独特特化的血管区室，其表型与淋巴结特异性信号和免疫功能紧密偶联。

HEVs在形态、分子和功能上均区别于常规静脉。与衬里大多数血管的扁平内皮细胞不同，HEV内皮细胞呈饱满的立方体形态。HEVs维持高淋巴细胞的穿越速率，使淋巴细胞能够通过淋巴结持续循环。在分子层面，HEVs作为淋巴细胞进入的选择性门户，通过呈现特化黏附分子和趋化因子信号，在生理剪切力下协调多步白细胞黏附级联反应。HEVs的标志性特征之一是外周淋巴结地址素（PNAd）的表达，可由MECA-79抗体检测，该抗体识别HEVs上的硫酸化涎糖黏蛋白配体，并能与天然淋巴细胞表达的L-选择素（CD62L）相互作用。此外，除PNAd外，HEVs还上调VCAM-1等黏附分子，支持淋巴细胞的牢固黏附和穿越，同时维持CD31（PECAM-1）等泛内皮标志物。

尽管HEVs在体内的表征已相当充分，但能够忠实地再现功能性HEV表型的体外模型仍然有限。传统的二维（2D）内皮培养缺乏三维（3D）细胞外基质背景、基质支撑和依赖于剪切的信号传导，这对于HEV分化至关重要，导致立方体形态丧失和功能PNAd配体的表达失败。虽然动物模型保留了天然的淋巴结结构，但限制了实验控制、机制解析和可扩展性，并且不包括人源细胞，从而使得向人类健康和疾病的转化变得复杂。在肿瘤引流淋巴结中——肿瘤特异性淋巴细胞启动的主要场所——HEVs会随肿瘤的进展而被重塑，且这种重编程由原发肿瘤驱动，并在转移细胞到达淋巴结之前即已开始。肿瘤对HEV内皮施加了哪些直接改变，在体内很难确定，因为基质、免疫和血管生成信号同时作用。乳腺癌是这一问题尤为相关的场景，因为腋窝淋巴结受累程度是该疾病最重要的预后指标之一。在乳腺癌中，缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2的三阴性乳腺癌更具侵袭性，且预后通常较差。因此，我们将MDA-MB-231细胞——一种在体外具有侵袭性表型的三阴性细胞株——置于该系统中，以探究恶性细胞的信号是否会破坏HEV标志物表达和功能。非致瘤的MCF-10A乳腺上皮细胞在相同配置中用作对照。

在本研究中，我们设计了一种人源器官芯片，以再现HEV的结构和功能（"HEV芯片"）。该系统将三维工程化的人源血管整合到胶原蛋白-纤维蛋白细胞外基质（ECM）中，并引入人源成纤维网状细胞（FRCs）以提供基质支撑和淋巴结相关的微环境信号。FRCs的引入增强了工程化血管中HEV特异性标志物的表达，同时维持了内皮身份和连接完整性。HEV芯片还表现出增强的T淋巴细胞与血管腔面的黏附，表明其具有功能性HEV特征。然而，当引入MDA-MB-231乳腺癌细胞时，HEV标志物表达下降，内皮完整性受到破坏，这与我们在荷瘤小鼠淋巴结中观察到的体内结果一致。

结果

HEV芯片模型的细胞外基质组成和基质共培养参数的优化

为建立允许HEV样分化的微环境，我们开发了一个三维微流控平台，在其中将人源微血管血内皮细胞（BECs）嵌入胶原蛋白-纤维蛋白ECM中形成可灌注的工程化血管，并由人源成纤维网状细胞（FRCs）环绕。所测试的ECM配方为2.5 mg/mL纤维蛋白凝胶加胶原蛋白I凝胶（0.2、1.25、2.5 mg/mL），以近似与淋巴结血管相关的基质环境，这些环境富含纤维状胶原蛋白和纤维蛋白，并支持血管重塑和免疫-基质相互作用（图1A）。所有条件下纤维蛋白浓度保持恒定在2.5 mg/mL，因为该浓度能可靠地支持在微流控器件中形成稳定可灌注的微血管网络，从而允许胶原蛋白I作为单一实验变量进行变化。含或不含FRCs（50,000 cells/mL）的ECM被引入腔室（图1B）。两天后，移去针头，并将BECs接种到其中一个中空通道中。器件随后在摇摆平台上培养14天，该过程在工程化血管内引入双向流动和剪切应力。在此过程中，一部分器件额外接受外源性LIGHT——一种炎症性细胞因子，可激活淋巴毒素-β受体——以测试LIGHT诱导的信号是否能在FRCs效应之外促进HEV表型。14天培养结束后，器件被固定并进行MECA-79和DAPI免疫染色以评估HEV分化。免疫荧光图像以及对MECA-79强度（以DAPI信号归一化）的定量显示，在所有ECM条件下，无FRCs培养的BEC通道中的MECA-79信号极低（图1C和1D）。相比之下，与FRCs共培养的BECs在14天后显示出显著增加的MECA-79表达，表明获得了HEV相关特征（图1C和1D）。然而，HEV样分化并不依赖于LIGHT的添加（图1C和1D），这与近期体内发现即HEV身份的LIGHT非依赖性维持一致。MECA-79信号在含FRCs的基质中以中等至高胶原蛋白浓度时最高。在支持强烈MECA-79诱导的条件中，1.25 mg/mL胶原蛋白I被选择用于后续所有实验，因为它在这些图像中观察到的血管形态上保持了血管结构。为确认FRC依赖性MECA-79是在共培养过程中诱导而非在接种时就已存在，我们另外在一组器件中对MECA-79和DAPI进行了染色，时间点为第0天，即BEC接种后一天、14天共培养之前（图S1A）。基线MECA-79信号较低，在?FRC和+FRC通道之间无统计学差异（图S1B），表明第14天的MECA-79信号反映的是FRC驱动的转化，而非预存或单纯维持的基线水平。

图1 HEV芯片模型细胞外基质组成与基质共培养条件的优化

(A) 微流控HEV芯片装置示意图：一个嵌入在含有成纤维网状细胞（FRCs）的三维胶原蛋白-纤维蛋白细胞外基质（ECM）中的可灌注血内皮细胞（BEC）通道，重现了淋巴结血管周基质微环境。
(B) 实验时间线：含或不含FRCs（50,000 cells/mL）的ECM聚合，2天后接种BEC，在双向摇摆流动下共培养14天；上排，仅内皮（?FRC）；下排，内皮-FRC共培养（+FRC）。
(C) 第14天不同胶原蛋白I浓度（0.2、1.25、2.5 mg/mL，纤维蛋白恒定2.5 mg/mL）下，含或不含FRCs及LIGHT的BEC通道的代表性共聚焦免疫荧光图像，染色为MECA-79/PNAd（品红色）和DAPI（细胞核，蓝色）；右侧为合并图像；代表n = 3–5个独立生物学重复样本。比例尺，200 μm。
(D) 第14天各ECM和共培养条件下MECA-79强度（以DAPI归一化）的定量（由浅至深 = 0.20、1.25、2.50 mg/mL胶原蛋白I）；n = 3–5个独立生物学重复样本；单因素方差分析（ANOVA）加Tukey事后检验。数据为均值±标准误；每个点为一个独立生物学重复。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，无统计学差异。

HEV芯片模型的特征化与体内验证

为测试基质支撑是否能同时驱动与HEVs一致的分子表型并维持内皮身份，我们对含或不含FRCs的HEV芯片器件进行了HEV相关和免疫黏附标志物MECA-79（PNAd）和VCAM-1的染色（图2A）。在无FRCs条件下，内皮通道表现出极低的MECA-79和VCAM-1表达，与非特化微血管表型一致（图2A）。相比之下，与FRCs共培养的血管表现出MECA-79信号和VCAM-1表达的显著增加（图2A）。定量分析证实了这一观察：与FRCs共培养显著提高了MECA-79和VCAM-1强度，相对于无FRCs对照（图2B和2C）。为评估芯片上观察到的标志物图谱是否反映了体内的HEV组织，我们对健康小鼠淋巴结切片进行了免疫荧光染色（图2D）。在淋巴结组织中，MECA-79和VCAM-1定位于HEVs特征性的离散血管结构上，而CD31在整个血管系统中广泛表达。这种空间分布与芯片上FRC支撑血管中观察到的模式高度平行，并与先前关于淋巴结中HEV特异性标志物定位的描述一致。

图2 基质支撑在芯片上诱导HEV相关标志物表达，并在体内再现淋巴结HEV图谱

(A) 含（+FRC）或不含（?FRC）FRCs培养的BEC通道的代表性共聚焦免疫荧光图像，染色为DAPI（蓝色）、VCAM-1（红色）和MECA-79/PNAd（品红色）；右侧为合并图像；代表n = 4–5个独立生物学重复样本。比例尺，100 μm。
(B和C) （B）MECA-79和（C）VCAM-1强度（以DAPI归一化）的定量，?FRC versus +FRC；n = 4–5个独立生物学重复样本；非配对双尾t检验。
(D) 健康小鼠淋巴结切片的代表性免疫荧光图像，染色为MECA-79（品红色）、VCAM-1（红色）和CD31（绿色），放大倍数10×和40×；代表n = 5只小鼠；比例尺，500 μm（10×）和100 μm（40×）。
(E) 工程化血管壁的垂直（横截面）共聚焦重建图像，?FRC versus +FRC，染色为DAPI（蓝色）和层粘连蛋白（红色）；右侧为合并图像。代表n = 3–4根血管/条件。比例尺，100 μm。
(F) 从共聚焦Z轴堆栈的垂直横截面中定量均层粘连蛋白阳性基底膜厚度，?FRC versus +FRC；每个点代表一根血管（沿该血管等距位置测量的五次厚度值的均值）；n = 4（?FRC）和n = 3（+FRC）根血管；非配对双尾t检验。
(G) 工程化血管的垂直（横截面）共聚焦重建图像，?FRC versus +FRC，染色为DAPI（蓝色）、MECA-79（品红色）、CD31（绿色）和裂解caspase-3（红色）；右侧为合并图像。代表n = 4根血管/条件。比例尺，100 μm。
(H) 从（G）中的垂直横截面定量均CD31阳性内皮壁高度（内皮细胞的顶底维度），?FRC versus +FRC；每个点代表一根血管（在该血管内相邻两个内皮细胞上测量垂直壁高的均值）；n = 4根血管/组；非配对双尾t检验。数据为均值±标准误；每个点为一个独立生物学重复（血管）。?p < 0.05。

除免疫荧光标志物外，HEVs还具有两个结构特征标志：在血管周基质支撑下沉积的增厚基底膜，以及饱满的立方体内皮。为评估其中第一个特征，我们在血管壁的垂直（横截面）共聚焦重建图像中观察了基底膜成分层粘连蛋白（图2E）。

在FRC支持的血管中，一层连续而突出的laminin阳性基底膜包裹着整个结构，而未加入FRC培养的血管仅显示出薄且稀疏分布的laminin信号。定量分析证实，与无FRC对照组相比，FRC支持的血管中laminin阳性基底膜显著增厚（图2F），表明基质支持驱动了工程血管周围的基底膜沉积。由于laminin反映的是基底膜而非内皮本身，我们另行通过观察FRC支持组与FRC缺失组血管的正交横截面中CD31的表达来评估内皮层（图2G）。CD31在两种条件下均标记出连续的内皮衬里，证实内皮特性得以维持，同时FRC支持的血管显示出明显更厚实的管壁，其中单个内皮细胞呈现立方形而非扁平形态。与CD31同时成像的剪切caspase-3在两种条件下均处于极低水平，表明这些结构差异的出现并未伴随内皮细胞活力的丧失。对CD31阳性内皮壁高度（以内皮本身的顶-基底方向为测量维度）的定量分析证实，与无FRC对照组相比，FRC支持的血管中该指标显著增加（图2H）。结合免疫荧光数据，这些结果表明FRC同时驱动了结构层面和分子层面的高内皮微静脉（HEV）特化。

**通过免疫细胞黏附与迁移功能验证芯片上HEV（HEV-on-chip）**
在确认FRC支持的血管获得了HEV关键分子与结构特征之后，我们进一步检验其是否也表现出HEV的标志性功能——招募循环淋巴细胞。为此，我们将Hut-78细胞（一种表达CCR7、常用于模拟淋巴细胞转运的人T细胞系）通过储液腔引入HEV管腔，并评估其黏附于管壁及沿管壁迁移的情况（图3）。24小时后，通过对DAPI、MECA-79、VE-cadherin及标记的Hut-78细胞（红色）进行免疫荧光染色，评估Hut-78对管壁的黏附情况（图3A）。未加入FRC培养的血管表现出有限的Hut-78黏附以及较低的MECA-79表达（图3A，上）。相比之下，FRC支持的血管在沿内皮表面显示出明显增加的Hut-78黏附，且在空间上与MECA-79染色增强的区域相吻合（图3A，下）。VE-cadherin在两种条件下的连接区域分布均保持连续，证实HEV的连接完整性得以维持（图3A）。定量分析证实，在FRC支持的HEV中，MECA-79表达显著增加，黏附的Hut-78细胞数量相应增加，而黏附连接未发生变化（图3B–3D）。MECA-79表达升高与淋巴细胞黏附增强之间的耦合，与PNAd介导淋巴细胞在HEV处锚定和滚动的已知作用一致。为选择黏附试验的终点并刻画免疫细胞相互作用的动力学过程，我们开展了时间梯度实验，使Hut-78细胞与HEV-on-chip血管相互作用0、6、24或48小时后进行固定（图3E）。0小时时无Hut-78细胞与血管结合，这定义了试验的基线而非测量条件；6小时时已出现黏附和迁移细胞，24小时达到峰值（相对0小时基线的增加具有统计学意义），48小时时不再进一步增加（图3F）。因此，Hut-78与HEV样血管的相互作用建立较早，在24小时达到最大，并持续至48小时而不再继续累积；基于此，我们将24小时作为后续所有黏附实验的终点。对固定于48小时的血管进行侧面体积重建显示，MECA-79阳性管壁连续完整，Hut-78细胞沿管壁及其内部分布，表明在整个共培养期内血管形态得以维持（图S2）。事实上，在静态和低流速条件下关于淋巴细胞-内皮相互作用的已有研究中报告了相似的时间动力学。

**图3 通过免疫细胞黏附与迁移对HEV-on-chip的功能验证**
(A) HEV-on-chip血管（分别以FRC支持或无FRC）与Hut-78 T细胞共培养24小时后的代表性共聚焦免疫荧光图像，分别染色DAPI（蓝色）、MECA-79/PNAd（品红色）、Hut-78（红色）及VE-cadherin（绿色）；右侧为合并图；每组n = 6–7个独立生物学重复的代表。比例尺：100 μm。
(B–D) 对以下项目的定量分析：(B) 黏附或迁移的Hut-78细胞数量；(C) 以DAPI归一化的MECA-79强度；(D) 以DAPI归一化的VE-cadherin强度；?FRC与+FRC比较；每组n = 6–7个独立生物学重复；非配对双尾t检验。
(E) Hut-78引入后0、6、24和48小时对MECA-79阳性血管的黏附代表性共聚焦图像，染色DAPI（蓝色）、MECA-79（品红色）和Hut-78（绿色）；每个时间点n = 3个独立生物学重复的代表。比例尺：75 μm。
(F) Hut-78引入后0、6、24和48小时黏附或迁移的Hut-78细胞数量定量；每个时间点n = 3个独立生物学重复；与0小时基线进行非配对双尾t检验。数据以均值 ± 标准误表示；每个点代表一个独立生物学重复。*p < 0.05。

**肿瘤相关微环境破坏HEV表型与血管完整性**
我们将HEV-on-chip平台改造为可在相邻微流控通道中容纳非恶性乳腺上皮细胞或恶性乳腺癌细胞（三阴性乳腺癌，TNBC）（图4A）。该配置可在内皮细胞与肿瘤细胞不发生直接接触的前提下评估肿瘤相关因素对HEV表型及血管结构的影响，这对于研究转移前远离原发肿瘤的淋巴结具有重要意义。

**图4 乳腺癌相关微环境破坏HEV表型与血管屏障完整性**
(A) 双通道HEV-on-chip示意图：FRC包埋于胶原-纤维蛋白细胞外基质（1.25 mg/mL Ⅰ型胶原，2.5 mg/mL纤维蛋白）中，BEC接种于一个通道，相邻通道保持无细胞状态或接种MCF-10A或MDA-MB-231细胞。
(B) 各条件下（BEC?FRC、BEC+FRC、BEC+FRC+MDA-MB-231、BEC+FRC+MCF-10A）的代表性共聚焦免疫荧光图像，染色DAPI（蓝色）、MECA-79（品红色）、剪切caspase-3（红色）和CD31（绿色）；右侧为合并图；每个条件n = 4个独立生物学重复的代表。比例尺：100 μm。
(C–E) 对以下项目的定量分析（以DAPI归一化）：(C) MECA-79；(D) 剪切caspase-3；(E) CD31强度；每个条件n = 4个独立生物学重复；单因素方差分析并辅以Tukey事后检验。
(F) 在相同条件下使用70 kDa FITC-葡聚糖测得的扩散渗透系数；每个条件n = 6–7个独立生物学重复；单因素方差分析并辅以Tukey事后检验。
(G) 相同条件下的血管直径；每个条件n = 6–7个独立生物学重复；单因素方差分析并辅以Tukey事后检验。
(H) 健康小鼠及荷E0771肿瘤小鼠淋巴结的代表性免疫荧光染色，分别标记VCAM-1（红色）、CD31（绿色）和MECA-79（品红色），倍率为10×和40×；每组n = 5–7的代表；比例尺：200 μm（10×）和75 μm（40×）。
(I–K) 对以下项目（以DAPI归一化）的定量分析：(I) MECA-79；(J) VCAM-1；(K) CD31强度；健康淋巴结与荷瘤（肿瘤）淋巴结比较；每组n = 5–7；非配对双尾t检验。数据以均值 ± 标准误表示；每个点代表一个独立生物学重复。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；ns，无统计学差异。

对MECA-79、CD31、剪切caspase-3和DAPI进行免疫荧光染色显示，在肿瘤相关条件下HEV特性发生选择性丧失（图4B）。与我们的前期结果一致，未加入FRC培养的血管MECA-79信号极低，而FRC支持的血管表现出强烈的MECA-79表达（图4C）。将MDA-MB-231细胞引入相邻通道后，MECA-79表达降至与无FRC对照组相当的水平，而非恶性MCF-10A细胞则未削弱MECA-79信号（图4C），表明HEV标志物表达丧失具有恶性微环境特异性，而非对相邻上皮细胞的泛化反应。重要的是，剪切caspase-3信号始终处于低水平，各组之间无显著差异（图4D），表明这一变化未伴随凋亡增加。相对于BEC-FRC基线，CD31在MDA-MB-231条件下显著降低（图4E），表明恶性暴露下出现内皮CD31的部分丢失。

由于标志物表达本身并不能反映血管功能，我们还直接灌注70 kDa FITC-葡聚糖并定量扩散渗透系数来评估屏障完整性（图4F）。缺失FRC的血管表现出最低的渗透性，与紧密封闭但未特化的微血管屏障相符。FRC支持的HEV样血管渗透性略有升高，但差异无统计学意义。相比之下，暴露于MDA-MB-231细胞的血管相对于FRC支持组及MCF-10A组的渗透性出现升高，揭示出一种屏障完整性功能丧失，而这种丧失仅凭CD31染色并不能显现。各条件下的血管直径无显著差异（图4G），表明这种渗透性升高更可能反映屏障功能改变，而非血管宏观重塑。综合来看，这些数据表明，在最初的48小时暴露期内，肿瘤相关信号从两个维度损害HEV血管——HEV特异性标志物表达丧失以及屏障功能丧失——与此同时内皮细胞仍保持存活（剪切caspase-3低）、血管口径未改变（直径无变化），且表现为CD31部分减少而非整体性内皮丢失。

为确定这些肿瘤相关改变是否再现了体内淋巴结重塑，我们检测了健康小鼠与荷瘤小鼠淋巴结中HEV标志物的表达（图4H）。荷E0771肿瘤小鼠的淋巴结表现出明显降低的MECA-79和VCAM-1表达以及改变的血管组织，定量分析证实相对于健康对照，MECA-79、VCAM-1和CD31强度均显著降低（图4I–4K）。这些体内变化与芯片上的发现相平行。

**讨论**
本研究证明，微血管内皮可通过血管周基质及细胞外基质（ECM）信号诱导获得与HEV相关的分子和功能特征，且无需外源性LIGHT。FRC支持条件下MECA-79的上调表明内皮糖基化程序被激活，这是HEV的特征。已有研究表明，PNAd的表达依赖于严格调控的硫酸化和糖基转移酶活性，而常规内皮培养体系极少能维持这些条件。这些配体由内皮糖蛋白（如CD34、endo-mucin和podocalyxin）携带，其功能依赖于精确的糖基化与硫酸化，而这由包括GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2在内的酶介导。增厚的laminin阳性基底膜沉积（图2E和2F），连同FRC支持血管CD31阳性内皮壁高度增加以及饱满的立方体形态内皮（图2G和2H），表明基质信号驱动了结构层面与分子层面的HEV特化。这一过程在内皮特性与活力得以维持的同时发生，反映出HEV样分化，使这些血管区别于常规微静脉扁平的内皮。

HEV标志物表达依赖基质背景，这与越来越多的证据一致——即内皮特化由局部成纤维细胞群体动态调控。基质成纤维细胞通过旁分泌信号、ECM重塑以及机械约束来指导内皮特性，包括形成血管周鞘。这些发现支持这样的概念：HEV特性并非内皮的内禀状态，而是淋巴结微环境中持续微环境信号的产物。内皮细胞中淋巴毒素-β受体（LTβR）信号传导已被确定为HEV分化的关键调节因子，包括PNAd表达和HEV相关糖基化程序。然而，近期研究表明HEV的指定可独立于LTβR配体LIGHT维持，提示内皮LTβR信号整合了超越经典LIGHT依赖通路的多种基质与微环境输入。与此一致，单细胞转录组分析显示HEV是一个转录上明显区分但具有异质性的内皮亚群，受免疫状态、基质相互作用和疾病背景塑造。

HEV-on-chip模型展现出与HEV生物学一致的功能属性，包括增强的淋巴细胞黏附。Hut-78 T细胞对MECA-79阳性血管黏附增加反映了PNAd表达的功能意义，因为PNAd-L选择素相互作用是淋巴细胞在HEV处招募的核心。功能试验条件下VE-cadherin表达保持完整，表明免疫细胞黏附增加未伴随内皮屏障破坏（图3A）。与此一致，FRC支持的HEV样血管渗透性略高于无FRC微血管，但差异无统计学意义，符合天然HEV生理学特性——HEV相对于常规微静脉限制性较低，以维持持续的淋巴细胞外渗（图4F）。

将HEV-on-chip模型应用于肿瘤相关条件揭示了HEV表型与屏障功能的特异性丧失。肿瘤暴露的血管失去MECA-79表达并表现出明显的葡聚糖渗透性升高，而剪切caspase-3保持低水平且血管直径未受影响，表明内皮细胞未发生大规模死亡或塌陷。

CD31在MDA-MB-231暴露条件下出现部分降低（图4E），并且在相同的图像中，可见其从连续的细胞-细胞边界重新分布为弥散、不连续的模式（图4B），这与连接复合体重组织及部分内皮CD31丧失一致，而非内皮消融。肿瘤驱动的血管失稳定已有广泛报道，其机制涉及炎症性细胞因子、蛋白水解性细胞外基质重塑以及内皮连接复合体的失调。值得注意的是，我们的模型由这一相对温和的刺激便产生了显著的功能性和连接性破坏，但并未导致内皮存活率下降，提示这是一种早期阶段，在此阶段中屏障功能和连接组织结构受到损害，但内皮成分尚未完全丧失。该模型并不与已建立的肿瘤环境中更为严重的失稳定相矛盾，而是似乎隔离了这一上游反应，在更长暴露时间或接触依赖性暴露下，该反应预计会进展为明显的血管崩溃。

我们的体外模型重现了HEV在癌症条件下的体内行为。肿瘤小鼠淋巴结中HEV标志物减少，与芯片上的丧失情况一致，与先前的报道相符——即癌症相关的重塑选择性地损害HEV并促进免疫排斥。体内的CD31强度下降与芯片上的部分CD31降低平行，较大的体内效应与完整肿瘤引流淋巴结内更晚期的血管退行一致，在该环境中内皮成分通过基质、免疫和血管生成等输入进一步耗竭，这些超出了芯片上捕获的直接内皮反应范围。

我们的HEV-on-chip模型独特地实现了灌注性人微血管在含有FRCs的三维细胞外基质中的构建，具有可控的流量和剪切应力，实现了HEV分化和多种细胞标志物的空间组织，以及白细胞-内皮相互作用的实时可视化。该模型弥合了传统二维体外系统与复杂体内系统之间的差距。在免疫系统中，淋巴结-on-chip和免疫血管芯片平台已被提出作为研究免疫细胞转运、基质-血管串扰以及疾病相关重塑的工具。在此背景下，本文开发的HEV-on-chip平台提供了一种可控系统，用于研究微环境信号如何调节HEV分化和免疫-血管相互作用，同时也能用于探索病理状态，如可能破坏HEV表型和淋巴细胞募集的癌症相关环境。

研究局限性

这一还原论平台隔离了血管周围基质对HEV特化的贡献，且该设计带来若干简化。因此，分子读数依赖于空间分辨的免疫荧光和功能检测，因为每个设备中的细胞数量较少，且无法在共培养裂解液中分离内皮与FRCs的贡献，从而限制了Western blot和qPCR的适用性。同样，分泌的趋化因子无法清晰地归属于内皮细胞、FRCs或（在癌症条件下）肿瘤细胞，因此未评估趋化因子水平的调控。体内比较侧重于淋巴结（HEV的生理部位），由于无法获得匹配的人体淋巴结样本而使用小鼠组织；这些反应在不同血管床中是否具有HEV特异性仍有待确定。所有体内实验均使用雌性小鼠，因此未评估潜在的性别依赖性效应。最后，工程化血管比天然淋巴结HEV更大；该平台优先在成像和灌注兼容的尺度上实现分子、结构和功能保真度，而非重现天然尺寸。

未来工作可通过纳入额外的淋巴结群体（包括树突状细胞、巨噬细胞和淋巴管内皮细胞）以及测试额外的基质和淋巴细胞群体来增加生理复杂性。更深入的FRC免疫表型分析将进一步界定基质区室。可通过改变剪切大小以及比较双向与单向灌注来检验流动的贡献。将该平台扩展至人体淋巴结组织和额外的血管床将进一步确立其通用性。从机制上，药物或基因扰动可解析NF-κB信号、机械转导以及HEV诱导和癌症相关破坏中细胞外基质介导的糖基转移酶调控的作用。在癌症模型中，该平台还可测试稳定内皮连接或恢复HEV相关糖基化以促进免疫细胞进入的策略。

资源可用性

主要联系人

进一步的资源信息和要求应由主要联系人Esak Lee（[e-mail]）提供并履行。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

- 数据：本文报道的所有数据将在合理请求下由主要联系人共享。
- 代码：本研究未生成代码。
- 所有其他项目：本文中所有其他可用项目将在合理请求下由主要联系人共享。

致谢

感谢Harry Peng为本研究提供小鼠淋巴结样本。作者获得了NIH（R01CA279560，R01HL165135）和NSF（CAREER Award CBET 2338610）的支持。

作者贡献

E.O.和E.L.构思并设计了研究方案。E.O.进行了实验。E.O.和E.L.撰写了稿件。

利益声明

作者声明不存在竞争性利益关系。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 大鼠单克隆抗MECA-79（周围节点地址素，PNAd） | Novus Biologicals | NB100-77673 |
| 抗VCAM-1 | R&D Systems | AF809 |
| 抗层粘连蛋白 | Invitrogen（Thermo Fisher Scientific） | PA1-16730 |
| 抗CD31 | Invitrogen（Thermo Fisher Scientific） | PA5-143217 |
| 抗裂解caspase-3 | Cell Signaling Technology | 9661T |
| 抗VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 |
| **生物样本** | | |
| 小鼠淋巴结（健康和E0771肿瘤引流） | 康奈尔大学 | N/A |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| 重组人LIGHT/TNFSF14 | R&D Systems | Cat# 664-LI-025 |
| I型胶原蛋白（鼠尾） | Corning | 354236 |
| 纤维蛋白原 | Millipore Sigma | F3879 |
| 凝血酶 | Millipore Sigma | T7513-100U |
| 70 kDa FITC-右旋糖 | Invitrogen | D1823 |
| 聚-L-赖氨酸（0.01% w/v） | Sigma-Aldrich | P8920-100mL |
| 戊二醛（1%） | Electron Microscopy Sciences（EMS） | 16310 |
| PDMS（Sylgard 184） | Ellsworth Adhesives | 2065622 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 62248 |
| 多聚甲醛（PFA） | Thermo Fisher Scientific | 50–980-495 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 0332-500G |
| Matrigel | VWR International | 47743–722（CS） |
| EGM-2 MV内皮生长培养基 | Lonza | CC-3202M |
| MCF-10A生长培养基 | Lonza | CC-3150 |
| 低糖DMEM | Gibco | 11885–084 |
| IMDM | ATCC | 30–2005 |
| HEPES（20 mM） | Thermo Fisher Scientific | 12320032 |
| 胎牛血清（FBS） | Cytiva | SH30071.03 |
| 青霉素-链霉素；L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 |
| **实验模型：细胞系** | | |
| 人真皮微血管血内皮细胞（BECs） | Lonza | CC-2543 |
| 人成纤维网状细胞（FRCs） | ScienCell | 2530 |
| 人：Hut-78（T淋巴细胞） | ATCC | TIB-161 |
| 人：MDA-MB-231（TNBC） | ATCC | HTB-26 |
| 人：MCF-10A（非恶性乳腺上皮） | ATCC | CRL-10317 |
| 小鼠：E0771（TNBC） | Ubigene | YC-C034-Luc-P |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| 小鼠：C57BL/6J（野生型） | The Jackson Laboratory | 品系#000664；RRID:IMSR_JAX:000664 |
| **软件和算法** | | |
| ImageJ/Fiji | NIH | RRID:SCR_003070（ImageJ）/SCR_002285（Fiji） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | RRID:SCR_002798 |
| MATLAB | MathWorks | RRID:SCR_001622 |
| Leica LAS X | Leica Microsystems | RRID:SCR_013673 |
| 扩散渗透率分析脚本（改编自Polacheck等） | 本文；Polacheck等 | N/A |
| **其他** | | |
| Leica SP8共聚焦显微镜（10×、40×物镜） | Leica Microsystems | N/A |

实验模型和受试者详情

细胞系和原代培养

人真皮微血管血内皮细胞（BECs）购自Lonza，使用Lonza的EGM-2MV培养基培养，补充1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素。人成纤维网状细胞（FRCs）购自ScienCell，使用ThermoFisher的低糖杜氏改良鹰培养基（DMEM）培养。BECs和FRCs使用第3–8代。Hut-78细胞购自ATCC，使用ATCC的Iscove改良杜氏培养基（IMDM）培养。MDA-MB-231细胞购自ATCC，E0771细胞购自Ubigene；两者均在含10%胎牛血清（FBS）和20 mM HEPES（ThermoFisher）的DMEM中培养。MCF-10A细胞购自ATCC，使用MEGM乳腺上皮细胞生长培养基（Lonza，货号#CC-3150）培养。所有细胞均在标准组织培养箱中于37°C、95%湿度和5%二氧化碳条件下维持。细胞系通过短串联重复（STR）分型进行鉴定，并常规检测支原体污染。

小鼠

野生型雌性C57BL/6J小鼠（The Jackson Laboratory，品系#000664；RRID:IMSR_JAX:000664）用于体内实验。小鼠在特定无病原体条件下饲养，每笼最多五只群养，处于12小时光照/12小时黑暗周期，20°C–22°C，相对湿度40–60%，自由摄食标准啮齿动物饲料和水。所有动物操作均经康奈尔大学实验动物护理和使用委员会批准，并按照相关的机构和国家标准与法规进行。为在免疫健全宿主中模拟HEV表型，使用同源性小鼠三阴性乳腺癌细胞系E0771代替人源细胞系MDA-MB-231。六周龄小鼠随机分配至肿瘤组或非肿瘤对照对照组。肿瘤组小鼠在第二乳腺脂肪垫中原位植入1×10? E0771细胞（悬浮于100 μL Matrigel中）；接种后第30天收集肿瘤引流淋巴结。从非肿瘤对照小鼠中收集同龄健康淋巴结。小鼠未经过任何药物或实验处理。所有小鼠实验均按照批准的实验动物护理和使用委员会（IACUC）方案进行（批准号：2020–0106）。

方法详情

微流控设备

微流控设备采用标准软光刻技术制造，如先前所述并进行了本研究的特定修改。设备由包含微流控结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层组成。PDMS（Sylgard 184，Dow Corning）通过与固化剂混合（10:1比例），倒在模具上，并在60°C过夜固化制备。PDMS通过氧等离子处理进行表面活化。通道通过等离子处理变为亲水性，并依次用0.01%（w/v）聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich）和1%戊二醛（EMS）进行功能化。设备在室温下在摇床上放置过夜以去除残留污染物。无菌不锈钢针（包被牛血清白蛋白，VWR）纵向插入每个设备。胶原-纤维蛋白水凝胶通过将I型胶原蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS）和NaOH中和制备，最终胶原蛋白浓度为1.25 mg/mL，纤维蛋白以2.5 mg/mL的浓度掺入。指示时，FRCs在装载前以50,000 cells/mL的浓度悬浮于水凝胶中。水凝胶溶液被移入设备，允许聚合一小时，并在FRC培养基中过夜孵育。BECs以500,000 cells/mL的浓度重悬，将120 μL细胞悬液引入每个中空通道。接种设备在组织培养箱中于摇动条件下维持14天，每48小时更换培养基。设备维持在二维摇动平台上，该平台产生双向重力驱动的血管通道流动；在我们的摇动参数下，这产生约4 dyn/cm2量级的估计峰值壁面剪切应力，与此前对该微流控平台的表征一致。双向流动是摇床驱动设计的固有特征，虽然单向灌注更具生理性，但工程化血管仍然发育出标志性的内皮特征，包括流动对齐形态和连续的VE-cadherin连接。

对于LIGHT处理条件，重组人LIGHT/TNFSF14（R&D Systems，货号#664-LI-025）按照制造商说明进行复溶，并以1 μg/mL的最终工作浓度添加到内皮培养基中。LIGHT补充在BEC接种后立即开始，并在整个14天培养期间每次48小时换液时补充，直至固定。

免疫荧光

设备内的细胞用PBS中的4%多聚甲醛（PFA）固定，并在4°C下用PBS中的3%牛血清白蛋白（BSA）封闭过夜。然后将一抗在设备内于4°C下孵育过夜。MECA-79（NovusBio）、VCAM-1（R&D）、层粘连蛋白（Invitrogen）、CD31（Invitrogen）、VE-Cadherin（Santa Cruz Biotechnology）和裂解caspase-3（Cell Signaling）以1:100的稀释度用于评估HEV相关标志物表达、内皮身份、连接完整性和细胞存活率。经再次洗涤后，为可视化细胞核，在二抗（1:500）于4°C下孵育过夜时加入DAPI（Sigma-Aldrich，1:500）。染色后，设备在暗处用PBS于4°C下洗涤过夜。共聚焦成像使用配备10×和40×物镜的Leica SP8共聚焦显微镜进行。通过微血管和周围细胞外基质的全厚度采集z轴堆叠图像。图像处理（包括最大强度投影、亮度和对比度调整）使用ImageJ进行。所有图像调整在实验条件间统一应用。对于定量分析，在ImageJ中对所有条件统一应用单一强度阈值。

扩散渗透率和血管直径

使用70 kDa FITC-右旋糖（Life Technologies）定量屏障功能。将右旋糖用培养基稀释至25 μg/mL，将50 μL移入设备的一个储液器；由此产生的静水压差驱动溶液通过连接的血管通道。为限制该初始加载压力造成的伪影，成像仅限于注射储液器下游一个单一10×视场内的一段血管区域。使用Leica SP8共聚焦显微镜以5秒间隔记录5分钟的右旋糖荧光，每根血管产生60张连续图像。扩散渗透系数根据血管周围细胞外基质荧光强度随时间变化的斜率计算，使用改编自Polacheck方法的自动MATLAB脚本。血管直径从相同的时间序列采集数据中提取，使用相同的自动MATLAB脚本，并在条件间进行比较。

基底膜厚度

基底膜厚度从层粘连蛋白染色的血管共聚焦z轴堆叠中定量，作为工程化血管周围沉积基底膜的形态学读数。使用Leica LAS X软件从z轴堆叠中重建每根工程化血管的正交横截面视图。在ImageJ中，沿血管在大致等间隔位置绘制五条垂直于层粘连蛋白阳性基底膜的线段，并在每个位置测量基底膜厚度。

五项测量值取平均值，得到该血管的单个体均厚度值，每个血管贡献一个数据点；?FRC条件下分析了n = 4个血管，+FRC条件下分析了n = 3个血管。内皮壁高度

内皮壁高度通过CD31染色血管的共聚焦Z-stack单独量化，作为内皮自身顶-基维度的形态学读出指标。使用Leica LAS X软件从Z-stack重建每个工程化血管的正交横截面视图。在ImageJ中，垂直于血管壁，在给定的血管内跨越两个相邻内皮细胞测量CD31阳性内皮壁的高度。将这两项测量值取平均值，得到该血管的单个体均壁高值，每个血管贡献一个数据点；每个条件下分析了n = 4个血管。小鼠淋巴结免疫荧光

组织经冷冻切片后厚度为10 μm，室温下用冰冷的4% PFA固定15分钟，用PBS洗涤3次，室温下用0.02% PBST通透15分钟。然后，组织在湿盒中用PBS中的5% BSA封闭1小时，在1% BSA中与一抗（MECA-79、VCAM-1和CD31，分别来自NovusBio、R&D Systems、Invitrogen，均为1:100稀释）在4°C下孵育过夜，洗涤3次，在4°C下与二抗（Invitrogen，1:500稀释）孵育过夜，再洗涤3次后进行成像。

定量与统计分析

统计分析使用GraphPad软件完成。两个独立组之间的比较采用非配对双样本t检验。组间评估采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验。在Hut-78黏附时间过程（图3F）中，24小时时间点与0小时基线之间采用非配对双尾t检验进行比较。所有数据以均值 ± 均数标准误（SEM）表示。每个数据点代表一个独立的生物学重复（芯片实验中的单个微流控装置，体内淋巴结实验中的单只小鼠），每个图注中均报告了确切的n值。

补充信息（2）
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文件S1：图S1和图S2
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文件S2：正文及补充信息