全身性昼夜节律烟酸核糖苷（NaR）信号通过预折叠蛋白复合体启动未折叠蛋白反应和脂肪生成

《Cell Reports》：A systemic circadian nicotinic acid riboside (NaR) signal engages the unfolded protein response and adipogenesis via the prefoldin complex

　　

**要点**

- 循环烟酸核糖苷（NaR）节律依赖于昼夜节律钟
- 肝脏钟足以产生NaR节律
- NaR通过预折叠蛋白复合物调控未折叠蛋白反应（UPR）信号通路和Cebpa表达
- 节律性NaR促进脂肪生成，而慢性暴露则抑制该过程

**摘要**

昼夜光暗周期造成环境波动，需要生理功能的协调调控。这种协调由昼夜节律钟介导，该钟由组织振荡器网络组成；然而，在器官之间传递昼夜节律信息的信号仍不明确。我们发现烟酸核糖苷（NaR）是一种循环代谢物，其节律性依赖于肝脏钟。在脂肪细胞和神经元中，NaR激活未折叠蛋白反应（UPR）。蛋白质组学稳定性谱分析表明，预折叠蛋白复合物是NaR的作用靶标，将NaR暴露与蛋白质稳态改变联系起来。在脂肪细胞中，NaR诱导的UPR信号汇聚于转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPA）。持续的NaR暴露抑制脂肪细胞脂质沉积，而时间受限的NaR刺激则增强脂肪生成。总之，这些发现将NaR鉴定为一种肝脏钟控制的循环代谢物，将全身昼夜节律代谢与蛋白质稳态及组织重塑联系起来，揭示了一种时间性代谢信号塑造组织特异性生理结果的模式。

**图形摘要**

**引言**

地球上的生命在可预测的24小时光暗周期中演化而来，推动了昼夜节律机制的产生，该机制在时间上组织生理和代谢过程。在哺乳动物中，这种组织由遗传编码的分子钟介导，使细胞过程与环境时间信号对齐。在分子水平上，昼夜节律源于转录-翻译反馈回路，其中激活复合物脑和肌肉ARNT样蛋白1（BMAL1）与昼夜运动输出循环卡普特蛋白（CLOCK）或神经元PAS结构域蛋白2（NPAS2）驱动节律性基因表达，包括其自身抑制因子Period（PER）和隐花色素（CRY）蛋白的表达。这些反馈回路在几乎所有组织中产生近24小时的基因表达振荡，为每个有核细胞提供内在的计时机制。虽然昼夜节律钟的分子架构已明确定义，但越来越多的证据表明，昼夜节律生理学源于组织钟之间的协调相互作用，而非来自孤立的振荡器，且昼夜节律计时信息如何在器官之间传递以确保一致的系统性代谢调控仍不完全清楚。

全身代谢等生理过程在各组织间表现出稳健的时间一致性，并可被环境挑战动态重编程。这种一致性由形成协调的器官间网络的组织钟维持，使全身生理与外部时间信号对齐。最近的研究开始揭示该网络的复杂性，表明协调的昼夜节律调控源于多个组织钟之间的相互作用，而非孤立的振荡器。这些相互作用受内在钟功能以及行为、环境和生理因素影响，凸显了全身昼夜节律调控的动态性。

我们此前证明，仅大脑钟即可恢复大部分循环代谢物的节律，且将进食限制在活动期同样可在缺乏钟基因的小鼠中恢复部分代谢节律性。然而，少数循环代谢物在缺乏外周组织钟时无法恢复节律性，这些代谢物的身份和生理作用仍知之甚少。这些钟依赖性代谢物可能通过外周钟整合进食信号来调节，并可能作为全身信号协调跨组织的能量代谢。虽然多种代谢途径参与昼夜节律稳态，但越来越多的证据突出了色氨酸代谢及相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）通路在连接代谢状态与昼夜节律调控中的核心作用。

在此，我们证明色氨酸和NAD+通路的代谢物需要完整的昼夜节律钟系统来维持全身振荡。在NAD+中间产物中，烟酸核糖苷（NaR）表现出稳健的循环节律性，这在缺乏钟基因的小鼠中被消除，并伴随慢性升高的NaR水平。为定义对NaR响应的细胞程序，我们在分化的脂肪细胞中进行了转录组谱分析。这种无偏分析揭示了选择性诱导未折叠蛋白反应（UPR）相关基因程序。随后的蛋白质组学稳定性谱分析表明预折叠蛋白复合物是NaR信号的分子靶标。功能上，NaR根据时间暴露差异调控脂肪细胞脂质积累，在脉冲刺激下促进脂质储存，但在连续处理中则不然。总之，这些发现将NaR鉴定为肝脏钟控制的循环代谢物，将全身昼夜节律代谢与脂肪细胞蛋白质稳态及分化状态联系起来。

**结果**

**钟系统在整合进食信号以控制循环代谢节律中的作用**

为鉴定由分子钟系统调控的循环代谢节律，我们重新分析了我们此前发表的昼夜节律血清代谢组学数据集，该数据集产生自夜间进食的野生型（WT）和全身Bmal1敲除（KO）小鼠。使用DryR框架进行节律性分析以鉴定钟依赖性振荡（图1A）。在检测到的923种血清代谢物中，376种在WT和KO小鼠中均表现出节律性（DryR模型4），而86种代谢物仅在WT小鼠中表现出节律性（DryR模型3），表明存在钟依赖性调控（图1B和S1A）。代谢物类别分布分析表明，进食驱动的节律大致反映了检测到的代谢物的总体组成（图S1B），这与进食-禁食周期对全身代谢振荡的主导影响一致。相比之下，钟依赖性节律代谢物显示出不同的类别分布，其特征是异生物体和辅因子/维生素富集，而脂质相对减少（图S1B）。值得注意的是，在辅因子/维生素类别中，与色氨酸-NAD+代谢相关的两种代谢物——奎宁酸和烟酸核糖苷（NaR）——涌现为钟依赖性候选物（图1C）。

**图1 昼夜节律对进食信号的整合协调烟酸核糖苷（NaR）的全身和肝脏节律**

（A）实验设计示意图（由BioRender.com制作）。在昼夜节律周期各时间点采集每个基因型四个生物学重复的血清样本，并使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。

（B）表示使用DryR框架进行的事后节律性分析的江流图。

（C）来自WT（黑色）和全身Bmal1-KO（红色）小鼠的血清检测到的色氨酸-NAD+通路相关代谢物的标准化强度。基于DryR进行余弦分析以确认显著的昼夜节律性。显示余弦p值。数据以平均值±标准误（SEM）表示。

（D）实验设计示意图（由BioRender.com制作）。在昼夜节律周期各时间点从每个基因型采集四个生物学重复的肝脏样本，并进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。

（E）来自WT（黑色）、全身Bmal1-KO（红色）和肝细胞重组Bmal1（LRE，蓝色）小鼠的肝脏检测到的NaR标准化强度。基于DryR进行余弦分析以确认显著的昼夜节律性。显示余弦p值。数据以平均值±SEM表示。

我们的观察结果促使我们关注色氨酸-NAD+通路。对个体代谢物的检查揭示了不同的基因型依赖性节律模式。奎宁酸和NaR是唯一在血清中检测到的表现出钟依赖性振荡的代谢物，而胡芦巴碱、吡咯酸和ADP-核糖在WT和KO小鼠中均保持节律性，尽管后两者显示出基因型依赖性中位数的差异。相比之下，烟酰胺核糖苷（NR）仅在KO小鼠中表现出节律性，而色氨酸和烟酰胺（NAM）则无昼夜节律调控（图1C）。总之，这些数据表明，只有色氨酸和NAD+通路中特定子集的代谢物在循环中表现出钟依赖性节律性。

**肝脏钟足以整合进食信号并恢复肝脏NaR节律性**

肝脏是色氨酸和NAD+代谢的主要场所。因此，我们提出肝脏钟是否足以整合进食信号并恢复NaR节律性的问题。为此，我们重新分析了我们此前发表的肝脏代谢组学数据集，该数据集包括野生型（WT）、全身Bmal1敲除（KO）和肝细胞特异性Bmal1重组（LRE）小鼠（图1D）。在LRE小鼠中，昼夜节律钟功能选择性地在肝细胞中恢复，而在其他组织中仍缺失。所有动物均维持在时间限制进食条件下，食物获取限制在活动期（ZT12至ZT0），从而能在受控的进食-禁食信号下评估肝脏钟的充分性。

在肝脏检测到的894种代谢物中，约三分之一表现出钟非依赖性节律性（图S2A和S2B），凸显了时间限制进食对肝脏代谢的主导影响。此外，73种代谢物显示出肝脏钟依赖性振荡（图S2A和S2B），表明钟系统在针对性地为代谢节律做出贡献中的作用。在肝细胞特异性Bmal1重组后，与KO相比，涵盖氨基酸、碳水化合物、核苷酸和辅因子/维生素的广泛代谢物恢复节律性，这与肝脏钟作为整合进食衍生信号以控制代谢振荡的中心代谢调节器的功能一致。相比之下，大多数仅在WT小鼠中保持节律性的代谢物是脂质（图S2B），表明脂质代谢振荡需要依赖网络的跨组织钟协调。

我们随后检查了血清中色氨酸和NAD+通路内检测到的代谢物。其中，NaR、ADP-核糖、奎宁酸和吡咯酸在肝脏Bmal1重组后恢复节律性（图1E和S2C）。相比之下，肝脏烟酰胺核糖苷（NR）独立于钟状态振荡，而烟酰胺单核苷酸（NMN）仅在KO小鼠肝脏中表现出节律性（图S2C）。烟酸、NAM和色氨酸则未表现出节律性（图S2C）。总之，这些数据表明肝脏钟足以恢复奎宁酸和NaR的节律性，这两者是色氨酸-NAD+通路中在血清和肝脏中均呈钟依赖性的代谢物。虽然奎宁酸的全身调控与大脑毒性相关，但最近的研究表明NaR补充可持续衰老小鼠的全身NAD+水平。因此，我们将下游调查集中在NaR的作用上。

**NaR调控未折叠蛋白反应**

我们接着提出全身NaR水平是否有助于控制远距离器官的生物学功能。循环NaR节律性可能具有系统性的昼夜节律信号调节功能，作用于多个组织；然而，我们小组一直关注肝脏-脂肪时间通讯，我们最近证明肝脏钟在调节脂肪细胞节律性方面发挥核心作用。此外，鉴于NAD+代谢对脂肪组织功能已确立的重要性，我们选择研究NaR在脂肪细胞中的作用。虽然肾脏是NaR代谢的主要场所，我们提出脂肪细胞是否能摄取NaR以局部诱导NAD+水平。为此，分化的3T3-L1脂肪细胞用NaR处理后在1、2、4和6小时收获，以定量细胞内NaR和下游代谢物（图2A和S3A；表S1）。脂肪细胞中没有可检测的内源性NaR产生，而外源性NaR被快速摄取，在1小时内达到最大细胞内水平。相比之下，细胞内NAD+及相关代谢物增加更为渐进，在处理4至6小时后升高（图2A和S3A）。这些动力学表明脂肪细胞可以摄取NaR，后者随后诱导NAD+代谢。

**图2 NaR调控未折叠蛋白反应（UPR）**

（A）用100 μM NaR处理1、2、4和6小时的分化3T3-L1脂肪细胞的代谢组学分析。每组六个生物学重复。使用单因素方差分析和Fisher's LSD检验进行对照与各处理组之间的统计比较。****p值 < 0.0001。AUC：曲线下面积。数据以平均值±标准误（SEM）表示。

（B）体外NaR细胞处理实验及随后转录组谱分析的示意图（由BioRender.com制作）。

（C）火山图显示与对照相比，用100 μM NaR处理6小时的3T3-L1细胞中差异表达的基因。

（D）C中编码基因产物的通路富集分析。

（E和F）用不同浓度NaR处理6小时和1小时的分化3T3-L1细胞中Manf、Pdia6和总Xbp1的转录组分析。每组四个生物学重复。使用单因素方差分析和Fisher's LSD检验进行对照与各处理组之间的统计比较。*p值 < 0.05，**p值 < 0.01，***p值 < 0.001。数据以平均值±SEM表示。

（G）用100 μM β-NMN处理1、2、4和6小时的分化3T3-L1脂肪细胞的代谢组学分析。每组六个生物学重复。使用单因素方差分析和Fisher's LSD检验进行对照与各处理组之间的统计比较。*p值 < 0.05，**p值 < 0.01，****p值 < 0.0001。AUC：曲线下面积。数据以平均值±SEM表示。

（H）用100 μM β-NMN处理6小时的分化3T3-L1细胞中Manf、Pdia6和总Xbp1的相对表达。每组四个生物学重复。使用非配对Student's t检验确定组间显著差异。

数据以均值±标准误（SEM）表示。(I) 对分化中的3T3-L1细胞用100 μM NaR处理6小时后，进行Western blot分析，检测未切割的ATF6 (uATF6)、切割后的ATF6 (cATF6)、剪接的XBP-1S、ATF4及参考蛋白P84。每个时间点设置三个生物学重复。图中显示相对蛋白丰度的均值，误差线表示均值的标准误。组间统计比较采用双因素方差分析结合Fisher最小显著差异法（LSD）进行。???p值 < 0.001。数据以均值±标准误（SEM）表示。(J) 内质网应激各分支的示意图及其相应的药理学抑制剂（红色标注）（使用BioRender.com制作）。(K) 分化中的3T3-L1细胞单独使用UPR抑制剂或与100 μM NaR共处理6小时后，Manf、Pdia6及总Xbp1的相对基因表达。使用稳健回归与异常值剔除（ROUT）方法识别异常值。每组至少包含八个生物学重复。统计分析对每个基因分别进行，采用双因素方差分析，以处理（UPR抑制剂）和NaR共处理为因素，随后使用Fisher LSD检验比较每种抑制剂与其相应的共处理组。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01，???p值 < 0.001。数据以均值±标准误（SEM）表示。

为了确定对NaR有响应的细胞程序，我们对分化中的脂肪细胞用逐渐升高的超生理浓度NaR（0、1、10和100 μM）处理，并在处理1小时和6小时后采集样本，以区分NAD+诱导前后的效应（图2B；表S2）。我们首先关注用100 μM处理6小时的脂肪细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。重要的是，该处理不影响细胞活力（图S3B）。分析结果显示了一种高度选择性的转录反应，仅有23个基因发生显著变化（图2C）。对差异表达基因及其蛋白产物相互作用进行通路分析，揭示了两个相互关联的基因簇，一个富集了与胶原蛋白形成相关的基因，另一个富集了与未折叠蛋白反应（UPR）相关的基因（图2D）。NaR诱导的UPR相关基因包括Pdia6和Manf，两者均调控IRE1α活性和Xbp1 mRNA剪接，以及Xbp1本身。Manf和Pdia6的表达在6小时后表现出对NaR的剂量依赖性反应，而Xbp1的诱导仅在最高检测浓度下可被检测到（图2E），表明UPR相关基因程序呈分级参与。值得注意的是，在1小时时间点未见表达增加，甚至Xbp1表达在最高浓度下反而下降（图2F），提示这些效应可能由下游代谢物（如NAD+）介导，或源于对NaR的延迟性转录反应。为了确定这些基因的诱导是否反映了NAD+前体可用性增加的结果，我们用NMN处理脂肪细胞。虽然NMN被脂肪细胞快速摄取并提高了NAD+水平（图2G），但它并未改变Manf、Pdia6或Xbp1的表达（图2H），表明NaR独立于下游NAD+产生来诱导UPR。

接下来，我们调查了NaR影响了哪条UPR通路。为此，我们对未切割和切割后的ATF6（分别为uATF6和cATF6）、ATF4以及剪接的XBP1（XBP1S）进行了Western blot分析。NaR处理后仅诱导了cATF6（图2I）。为了验证NaR通过ATF6对Manf、Pdia6和Xbp1 mRNA表达的影响，我们将NaR刺激与针对三条UPR分支的药理学抑制剂联合使用：GSK2656157（GSK），一种PERK抑制剂；Ceapin-A7（CA7），一种ATF6激活抑制剂；以及4μ8C，一种IRE1 RNase活性抑制剂（图2J）。重要的是，接受任一化合物处理的细胞之间活力无差异（图S3C）。仅ATF6抑制剂CA7阻断了NaR介导的这些UPR转录本的诱导（图2K），支持NaR通过ATF6在3T3-L1脂肪细胞中诱导这些转录本。为了验证这些观察结果的人类相关性，我们用NaR处理分化中的人多能脂肪来源干细胞（hMADS）并评估UPR。在人细胞中，XBP1表达被诱导，而ATF6 mRNA表达下调（图S3D），且uATF6和XBP1S蛋白表达（而非ATF4）均显著减弱（图S3E）。这些观察结果表明NaR可调节小鼠和人分化脂肪细胞中的UPR，尽管这种反应具有种属依赖性，因此我们尚不能得出NaR在两种物种中通过相同机制发挥作用的结论。

UPR是一种全细胞应激反应，已被发现在多种生理和病理环境中发挥作用，包括肌肉对运动的适应和海马神经退行性变。因此，我们测定了经NaR处理的肌管（C2C12）和神经元（HT-22）细胞系中UPR标志基因的表达（图S3F–S3H）。肌管细胞中未观察到变化（图S3G），而神经元细胞显示出sXbp1表达增加的趋势，总Xbp1显著诱导（图S3H），表明NaR介导的UPR调节并非局限于脂肪细胞。

生理水平的NaR调节UPR

迄今为止，体外实验一直使用超生理浓度的NaR。循环NaR的生理浓度约为10 nM2?，是循环NMN水平的十倍，与循环烟酰胺核糖（NR）浓度相当。因此，我们使用培养基中的生理NaR浓度重复了实验。在所分析的UPR转录本中，仅有Atf4和Ddit3被诱导（图3A）。这促使我们测试NaR在诱导的内质网（ER）应激下的作用。因此，我们先用5 ng/mL紫孢菌素预处理细胞18小时，随后使用或不使用10 nM NaR处理6小时。在ER应激条件下，NaR减弱了多种UPR标志基因的诱导表达，包括sXbp1、Atf6、Ddit3和Hspa5（图3B）。我们通过Western blot在蛋白水平验证了这些观察结果，确实，10 nM NaR在基础条件下诱导了cATF6，同时减弱了紫孢菌素诱导的cATF6和ATF4水平，并进一步增加了XBP1S水平（图3C和3D）。这些观察结果表明NaR是UPR的调节因子，其激活或抑制作用取决于具体情境。因此，NaR可能是多种导致UPR振荡的因素中的一种调节因子。

图3 生理水平的NaR调节UPR

(A) 分化中的3T3-L1细胞用10 nM NaR处理6小时后经典UPR基因的qPCR相对表达。使用稳健回归与异常值剔除（ROUT）方法识别异常值。每组至少包含九个生物学重复。统计分析对每个基因分别进行，采用双因素方差分析，随后使用Fisher LSD检验。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01。数据以均值±标准误（SEM）表示。(B) 分化中的3T3-L1细胞单独用紫孢菌素处理或与10 nM NaR共处理6小时后经典UPR基因的相对基因表达。使用稳健回归与异常值剔除（ROUT）方法识别异常值。每组至少包含十个生物学重复。组间统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01，???p值 < 0.001，????p值 < 0.0001。数据以均值±标准误（SEM）表示。(C和D) 分化中的3T3-L1细胞单独用10 nM NaR处理或与紫孢菌素共处理6小时后，切割后的ATF6 (cATF6)、剪接的XBP-1S、ATF4及参考蛋白P84的Western blot分析。每组三个生物学重复。组间统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验。??p值 < 0.01，????p值 < 0.0001。数据以均值±标准误（SEM）表示。(E) 3T3-L1脂肪细胞用AML12 WT或Bmal1-KO细胞的条件培养基处理6小时后，总Xbp1、Ddit3和Atf4的Log2表达量（每个WT条件培养基组n = 4，每个KO条件培养基组n = 3）。图中显示Log2表达的均值，误差线表示均值的标准误。采用余弦分析（Cosinor analysis）评估昼夜节律的显著性。图中显示余弦分析的p值。数据以均值±标准误（SEM）表示。(F) 分化中的3T3-L1脂肪细胞用未经处理、AML12 siC或siNt5c2条件培养基处理6小时后，总Xbp1、Atf4、Atf6、Ddit3和Hspa5的相对qPCR表达。使用稳健回归与异常值剔除（ROUT）方法识别异常值。每组至少包含四个生物学重复。组间统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01，???p值 < 0.001。数据以均值±标准误（SEM）表示。

为了评估这些观察结果的体内相关性，我们利用先前发表的数据集检查了肝细胞特异性Bmal1基因敲除（LKO）小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠的白色脂肪组织（WAT）基因表达。在这些条件下，WT小鼠的Manf、Pdia6、Atf4和Hspa5在ZT16表现出明显的表达峰值，而在LKO小鼠中该峰值消失（图S4A）。相比之下，Xbp1、Atf6和Ddit3的表达在不同基因型间相似。此外，为了评估肝细胞时钟在调节WAT UPR表达方面的充分性，我们挖掘了已发表的数据集，该数据集包含Bmal1肝细胞重建小鼠（LRE，Bmal1表达限于肝细胞）的WAT转录组学数据，并与它们的WT和全身性敲除（KO）同窝小鼠进行比较。肝细胞特异性Bmal1重建足以恢复所有转录本的节律性表达（Manf和Ddit3处于显著性边界，余弦分析p值分别为0.0583和0.0704），除Atf6外，尽管与WT相比相位和振幅有所改变，且Xbp1和Ddit3的表达更接近KO小鼠（图S4B）。

为了探究肝细胞时钟向分化脂肪细胞的直接信号是否调节UPR节律性，我们转向了先前发表的样本，其中从同步化的有或无功能性时钟的AML12肝细胞中，在同步后不同时间窗口内收集条件培养基，并与分化中的3T3-L1脂肪细胞孵育6小时。我们对脂肪细胞进行了RNA测序分析并分析UPR转录本，结果发现Xbp1、Ddit3和Atf4在用WT AML12肝细胞条件培养基处理的脂肪细胞中表现出节律性，而在用Bmal1-KO AML12肝细胞条件培养基处理时这种节律性丧失（图3E和S4C；表S3）。此外，我们通过敲低Nt5c2——调控NaR的限速酶——来评估AML12肝细胞中Nt5c2通过条件培养基控制脂肪细胞UPR的贡献（图S4D）。敲低导致条件培养基中NaR水平出现适度但显著的下降（图S4E），并诱导了所有测量的UPR标志基因的表达（图3F），但sXbp1、Manf和Pdia6除外（图S4F）。综合这些数据表明，肝脏时钟功能对WAT中UPR相关基因的时间调控有贡献，而NaR信号是其中的一种调节因素。

体内补充NaR调节WAT和大脑中的UPR

接下来，我们探讨口服NaR补充是否可用于调节WT和LKO小鼠WAT、大脑和肌肉中的UPR。灌胃在ZT12（活跃期开始）进行，模拟人类觉醒后摄入补充剂的情况（图4A）。小鼠在灌胃4小时后处死，并在选定器官中分析UPR。在WAT中，多个UPR转录本呈现减弱趋势，其中Ddit3和Hspa5显著下调（图4B）。相比之下，LKO小鼠WAT中的基因均未受影响（图4B），这可能是由于LKO小鼠长期暴露于NaR并使其动态信号产生脱敏所致。在肌肉中，仅观察到对UPR基因表达的轻微影响，其中WT小鼠的Xbp1s显著诱导，LKO小鼠的Ddit3减弱（图4C）。在全脑样本中，NaR诱导了WT和LKO小鼠Manf的表达，而Atf4表达仅在WT小鼠中被诱导（图4D）。

综合而言，这些结果表明，NaR补充可用于全身性调节UPR系统。

图4 NaR体内补充调节白色脂肪组织和大脑中的UPR

（A）体内口服NaR补充的示意图（由BioRender.com创建）。

（B）野生型（WT）和肝脏特异性Bmal1基因敲除（LKO）小鼠口服生理盐水或NaR后，附睾白色脂肪组织（eWAT）中经典UPR基因的qPCR分析。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。每个WT组的生物学重复数为4，LKO组至少为5。组间统计比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA）配合Fisher最小显著差异检验（LSD test）。?p值 < 0.05。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。

（C）野生型（WT）和肝脏特异性Bmal1基因敲除（LKO）小鼠口服生理盐水或NaR后，腓肠肌中经典UPR基因的qPCR分析。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。每个WT组的生物学重复数为4，LKO组至少为5。图中表示相对基因表达的均值，误差线表示均值标准误。组间统计比较采用双因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。?p值 < 0.05。数据以均值±SEM表示。

（D）野生型（WT）和肝脏特异性Bmal1基因敲除（LKO）小鼠口服生理盐水或NaR后，全脑中经典UPR基因的qPCR分析。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。每个WT组的生物学重复数为4，LKO组至少为6。图中表示相对基因表达的均值，误差线表示均值标准误。组间统计比较采用双因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01。数据以均值±SEM表示。

**蛋白质组整体溶解度改变（PISA）分析揭示NaR与预折叠蛋白复合物的相互作用**

我们的数据表明，NaR通过独立于NAD?代谢全局变化的机制诱导UPR基因程序。因此我们提出，NaR是否直接作用于某些特定蛋白质，从而导致这种转录反应？为此，我们进行了蛋白质组整体溶解度改变（PISA）检测，以鉴定NaR依赖性蛋白质热稳定性的变化，该指标用于推断小分子与蛋白质的相互作用。对分化中的脂肪细胞用NaR处理1小时（此时细胞内NAD?水平尚未检测到升高），随后进行蛋白提取、热挑战和定量蛋白质组学分析（图5A）。在整个蛋白质组范围，13种蛋白质表现出热稳定性增加，16种蛋白质在NaR处理后显著不稳定化（图5B；表S4）。通路和蛋白质-蛋白质相互作用分析显示，稳定化的蛋白质之间连接有限，其中包括连接组蛋白如H1F4和H1F5，已知为染色质组织的调节因子（图S5A）。相比之下，不稳定化的蛋白质分为两个相互作用簇（图5C）。一个簇由细胞外基质相关蛋白质组成，包括FBN1和COL1A2。第二个簇包含PFDN5和PFDN6，即预折叠蛋白复合物的两个核心亚基。预折叠蛋白是一种异六聚体细胞质伴侣蛋白，能够捕获新生或部分折叠的多肽并将其递送至伴侣素（chaperonins）进行ATP依赖性折叠，因此直接与细胞蛋白质稳态相关。为进一步评估NaR是否更广泛地影响预折叠蛋白的完整性，我们检查了PISA数据集中检测到的各预折叠蛋白亚基的热稳定性变化。所有检测到的预折叠蛋白亚基在NaR处理后均表现出稳定性降低（图5D；表S4），这与预折叠蛋白复合物整体不稳定化一致。这种协同的不稳定化可能源于NaR与特定亚基的相互作用，进而对复合物组装或稳定性产生继发影响。因此，为确定NaR与预折叠蛋白亚基结合的可能性，我们进行了对接分析。我们首先鉴定出代谢物可能结合的口袋位点，随后对NaR进行对接分析。NaR被预测与所有预折叠蛋白亚基相互作用，包括小鼠（图S5B；表S5）和人类（图S5C；表S5）PFDN6中的一个结合口袋。为提供NaR与单个预折叠蛋白亚基相互作用的额外证据，我们在蛋白质裂解物上进行了改良的PISA检测，其中蛋白质复合物基本解聚。裂解物在处理后进行热谱分析。在此条件下，经多重检验校正后仅五个蛋白质的热稳定性改变达到显著水平（校正p值 < 0.05）；然而，有许多名义上显著且变化倍数较高的蛋白质（图S5D）。其中，PFDN1和PFDN6显示出名义上显著的热稳定性增加，PFDN6最为显著（图5E），提示NaR优先与PFDN1和PFDN6结合，且这种相互作用可能是完整细胞中观察到的预折叠蛋白复合物不稳定化的基础。

图5 PISA检测证明NaR与预折叠蛋白复合物之间存在相互作用

（A）PISA的原理和工作流程示意图（由BioRender.com创建）。

（B）火山图显示分化中3T3-L1细胞在未处理或用100 μM NaR处理1小时后的蛋白质差异性稳定性。

（C）NaR处理后不稳定化蛋白质的通路富集分析。

（D）PISA检测在活的3T3-L1细胞上（经100 μM NaR处理后）检测到的各预折叠蛋白亚基的蛋白丰度变化。每组四个生物学重复。采用非配对Student's t检验确定组间显著性差异。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01，???p值 < 0.001。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。

（E）PISA检测在细胞裂解物上（经NaR处理后）检测到的各预折叠蛋白亚基的蛋白丰度变化。每组四个生物学重复。采用非配对Student's t检验确定组间显著性差异。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01。数据以均值±SEM表示。

（F）分化中3T3-L1对照（siC）和Pfdn6敲低（siPfdn6）细胞中Manf、Pdia6和总Xbp1基因的相对表达量。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。每组生物学重复数至少为7。与siC组相比的统计比较采用单因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。?p值 < 0.05，??p值 < 0.01。数据以均值±SEM表示。

为确定特定预折叠蛋白亚基在脂肪细胞中调节UPR中的作用，我们在3T3-L1前脂肪细胞中进行了siRNA介导的Pfdn6敲低（选择裂解物分析中最为显著的亚基），随后诱导脂肪生成。siRNA处理导致Pfdn6表达显著降低（图S5E），与非靶向siRNA相比细胞活力无显著变化（图S5F），且伴随Manf表达水平升高、Xbp1表达减弱，而Pdia6无变化（图5F），突显了PFDN6在调节UPR中的重要性。

**NaR通过PFDN6和UPR信号通路调节脂肪细胞Cebpa表达**

已知UPR对脂肪生成是必需的。虽然我们的无偏RNA测序分析未在NaR处理后发现脂肪生成基因程序的广泛诱导（图2），但这可能反映了所采用的严格统计阈值。因此我们评估了饲喂普通饮食或60%高脂饮食（HFD）的WT和LKO小鼠的脂肪细胞形态，并以针对性关注关键脂肪生成调节因子的方式重新审视转录组数据。我们此前已报道了饲喂普通饮食的LKO小鼠的代谢表型，因此我们评估了饲喂高脂饮食的WT和LKO小鼠的体重、附睾白色脂肪组织（eWAT）储积量、食物摄入量、运动活动量、呼吸交换比（RER）和能量消耗（EE）（图S6A–S6F）。在体重、运动活动量、RER或EE方面均未观察到差异（图S6A、S6D、S6E和S6F）。然而，LKO小鼠表现出食物摄入量增加的倾向，这可能与改变向大脑调节摄食行为的迷走神经信号有关，同时附睾白色脂肪组织质量也增加（图S6B和S6C）。我们接下来检查这些变化是否伴随白色脂肪组织形态学改变（图6A–6C）。在饲喂普通饮食的小鼠中，WT和LKO小鼠的平均脂肪细胞大小无差异（图6A和6C）。然而，当接受致肥胖高脂饮食挑战时，LKO小鼠平均显示出更大的脂肪细胞（图6A和6C），表明其无法在热量过剩条件下有效诱导脂肪生成。高脂饮食对WT小鼠平均脂肪细胞大小的影响较轻微，这促使我们检查脂肪细胞大小分布。两组高脂饮食组均向更大脂肪细胞偏移；然而，WT组还表现出较小脂肪细胞频率的轻微增加，这可能反映了在热量过剩条件下新分化脂肪细胞的募集（图6B）。与这些观察一致的是，在我们3T3-L1转录组数据集中检测的脂肪生成基因中（包括但不限于Pparg、Adipoq、Plin1和Fabp4[表S2]），NaR刺激选择性地诱导了CCAAT/增强子结合蛋白α（Cebpa）的表达，我们通过qRT-PCR进行了验证（图6D）。我们进一步使用生理水平的NaR研究了其对Cebpa表达的影响，结果显示边界性显著的升高，而在诱导的内质网应激条件下则减弱（图6E）。然而，在基础条件下，CEBPA蛋白水平在生理性NaR刺激下显著升高，但与紫霉霉素联用时则不然（图6F）。这些观察与先前报道一致，表明XBP1通过Cebpa调节脂肪生成。此外，CEBPA是我们PISA分析中发现的不稳定化蛋白质之一（表S4），提示NaR可能通过同时作用于UPR和脂肪生成转录机制来促进脂质调节。因此，为确定NaR是否通过预折叠蛋白复合物介导Cebpa的转录诱导，我们将Pfdn6 siRNA处理与NaR处理相结合。如假设所示，在非靶向siRNA处理的细胞中，NaR导致Cebpa表达升高，而在siPfdn6处理的细胞中该效应被消除（图6G）。我们接下来试图确定UPR的哪条通路介导了这一效应。为解析UPR通路的作用，我们转向使用UPR信号通路的药物抑制剂的实验（图2I）。抑制ATF6和IRE-1均导致Cebpa表达持续抑制，且该抑制无法被NaR处理挽救（图6H）。综合而言，这些数据表明ATF6和IRE-1依赖性激活对NaR诱导的Cebpa表达至关重要，且该机制可能涉及预折叠蛋白复合物。这些观察与先前报道强调这些信号通路在脂肪生成中的参与相一致。

图6 NaR通过PFDN6和UPR信号调节脂肪细胞Cebpa表达

（A）饲喂普通饮食或60%高脂饮食（HFD）9周的WT和LKO小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT）脂肪细胞直径均值。每个点代表一只动物（每只动物三个成像视野的均值，使用ImageJ中的Adiposoft量化）。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。组间统计比较采用双因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。?p值 < 0.05。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。

（B）根据A中呈现的测量数据确定的脂肪细胞大小分布。图中表示WT普通饮食组（n = 8）、LKO普通饮食组（n = 10）以及HFD的WT组和LKO组（各n = 9）的均值。数据以均值表示。

（C）普通饮食和高脂饮食条件下WT和LKO小鼠的代表性苏木精-伊红（H&E）染色eWAT切片。比例尺，100 μm。

（D）分化中3T3-L1细胞用100 μM NaR处理1小时和6小时后，通过qRT-PCR测量的Cebpa相对基因表达量。每组四个生物学重复。对照组与各处理组之间的统计比较采用双因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。???p值 < 0.001。数据以均值±SEM表示。

（E）分化中3T3-L1细胞单独用10 nM NaR处理或与紫霉霉素联用处理6小时后的Cebpa相对表达量。使用稳健回归和离群值去除（ROUT）方法识别离群值。每组生物学重复数至少为11。与对照组相比的统计比较采用单因素方差分析配合Fisher最小显著差异检验。????p值 < 0.0001。

数据以均值±SEM表示。**(F)** 用10 nM NaR单独处理或与曲霉二酰胺(tunicamycin)联合处理6小时的分化3T3-L1细胞中CEBPA蛋白及参考蛋白P84的丰度。每组N=3。P84图像与图3C相同，因为这些样品是同时上样的。与对照组相比的统计比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Fisher最小显著差异(LSD)检验进行。??p值<0.01，????p值<0.0001。数据以均值±SEM表示。**(G)** 在分化3T3-L1细胞对照组(siC)和Pfdn6-KD(siPfdn6)细胞中，用或不用100 μM NaR处理6小时后的Cebpa相对表达量。离群值采用稳健回归与离群值剔除法(ROUT)进行识别。每组的生物学重复数至少为七次。与siC组相比的统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验进行。??p值<0.01，???p值<0.001，????p值<0.0001。数据以均值±SEM表示。**(H)** 用内质网应激(UPR)抑制剂单独处理或与100 μM NaR联合处理6小时的分化3T3-L1细胞中Cebpa的相对表达量。离群值采用稳健回归与离群值剔除法(ROUT)进行识别。每组至少包含八个生物学重复。统计分析采用双因素方差分析(two-way ANOVA)分别针对每个基因进行，以UPR抑制剂处理和NaR联合处理作为因子，随后采用Fisher LSD检验将每种抑制剂与其对应的联合处理组进行比较。???p值<0.001。数据以均值±SEM表示。**(I)** 体外恒定和脉冲式NaR处理方案的示意图(使用BioRender.com制作)。**(J和K)** 用恒定或脉冲式NaR方案处理8天后的3T3-L1细胞中，以TUBULIN为参考蛋白的CEBPA Western blot分析。离群值采用稳健回归与离群值剔除法(ROUT)进行识别。每组至少包含五个生物学重复。采用非配对Student's t检验确定组间显著性差异。?p值<0.01。数据以均值±SEM表示。**(L)** 用恒定或脉冲式NaR方案处理8天后的3T3-L1细胞脂质积累分析。采用非配对Student's t检验确定组间显著性差异。?p值<0.05，??p值<0.01。数据以均值±SEM表示。**(M)** 用脉冲式NaR方案处理8天后的3T3-L1对照组(siC)和Pfdn6-KD(siPfdn6)细胞脂质积累分析。离群值采用稳健回归与离群值剔除法(ROUT)进行识别。每组至少包含十一个生物学重复。与siC组相比的统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验进行。?p值<0.05，??p值<0.01。数据以均值±SEM表示。**(N)** 用脉冲式NaR方案处理8天后的3T3-L1对照组(siC)和Atf6-KD(siAtf6)细胞脂质积累分析。离群值采用稳健回归与离群值剔除法(ROUT)进行识别。每组至少包含十二个生物学重复。与siC组相比的统计比较采用单因素方差分析结合Fisher LSD检验进行。?p值<0.05，??p值<0.01。数据以均值±SEM表示。

**振荡式而非恒定式NaR信号调控脂质积累**

上述结果已确立NaR可诱导UPR相关基因程序并调控脂肪细胞中Cebpa的表达。我们进一步探讨了NaR暴露的时间结构是否影响脂肪细胞分化的结局。鉴于适应性与非适应性UPR信号传导取决于时间节奏和信号消退方式，我们假设振荡式和持续性NaR信号将被分化中的脂肪细胞以不同的方式进行解读。

为验证这一点，我们比较了脉冲式和恒定式NaR暴露对分化脂肪细胞脂质积累的影响。3T3-L1细胞要么在整个分化期间接受持续NaR处理(恒定NaR处理；8天)，要么接受每日8小时NaR脉冲后在16小时无NaR培养基中培养的交替处理方案(图6I)。恒定NaR处理未改变分化脂肪细胞中CEBPA蛋白水平(图6J)。相反，每日脉冲式NaR刺激则导致CEBPA蛋白丰度显著增加(图6K)。与这些CEBPA调控效应一致的是，脂质积累的定量分析显示，慢性NaR处理后每细胞脂质面积减少，而脉冲式NaR暴露则显著增加了每细胞的脂质积累(图6L、S6G和S6H)。为确定脉冲式NaR刺激是否通过预折叠蛋白复合物和UPR途径诱导脂质沉积，我们在Pfdn6或ATF6被敲低的细胞中重复了实验(图S5E和S6I)。PFDN6和ATF6均为脉冲式NaR介导其对脂质沉积效应所必需的(图6M、6N、S6J和S6K)。总之，这些数据表明脂肪细胞根据NaR信号的时间结构对其做出差异化解读，且其潜在机制可能涉及通过预折叠蛋白复合物介导的适应性UPR。振荡式NaR暴露促进脂肪生成能力和脂质积累，而持续性NaR暴露则抑制这些过程，这凸显了系统代谢信号时间模式在生理学中的重要性。

**讨论**

昼夜节律生理学的最新进展表明，系统性节律并非仅由孤立组织中的时钟产生，而是源于一个涉及多器官间通讯的耦合网络。虽然脑内时钟足以驱动大部分系统性代谢节律性，但肝脏时钟已被提出作为整合摄食信号的功能单元，以调节其他外周组织的节律性输出。支持这一模型的是，我们和其他研究者最近已证明肽类肝因子肽参与系统性代谢的组织。在本研究中，我们聚焦于循环代谢物作为信号中间体，扩展了肝脏时钟信号传导框架。我们的数据将NaR鉴定为肝脏时钟-WAT(白色脂肪组织)轴中的肝脏时钟受控代谢物，并进一步提出了通过预折叠蛋白复合物与蛋白质稳态相关联的机制联系。虽然此前的研究已证实肝脏时钟在调节肝脏内局部UPR信号中的作用，但我们的发现提出了一个可能性，即肝脏时钟的输出也可能影响远端组织中的UPR相关基因程序。我们的结果支持了此前关于肝脏是系统性昼夜节律核心协调者的观察。

虽然NaR最近被发现可循环并贡献于肝外NAD?池，但我们的数据表明，NaR的节律性本身可能传递超出其作为代谢前体角色的时间信息。通过证明NaR振荡在时钟缺陷状态中被选择性丧失并通过肝脏时钟功能得以恢复，我们的结果提出了NaR作为编码时间的代谢信号，将肝脏昼夜节律输出与系统性UPR调控及脂肪细胞生理相连接的可能性。在此背景下，NaR可能代表了一种代谢物的例子，其时间动态性而非绝对丰度，在器官间协调中发挥作用。我们的发现提出了一个重要的未解问题：为什么肝脏时钟选择性地将昼夜节律性赋予循环中的NaR，而其他NAD?中间体并不表现出类似的时钟依赖性。一种可能性是，NaR与喹啉酸一道，作为色氨酸-NAD?通路的检查点，缓冲来自从头合成NAD?通路的代谢输入。这一理论得到了此前研究的支持，即NaR的产生在Nmnat1(从头合成NAD?通路中的限速酶)缺失时被诱导。

从机制上看，我们观察到脂肪细胞对NaR处理产生了特异性转录反应，诱导了参与UPR的基因表达。重要的是，NaR对UPR的影响并非单向的，因为我们使用曲霉二酰胺的实验表明NaR在内质网应激下会抑制UPR。此外，在脂肪细胞的蛋白水平上，我们观察到ATF6途径的选择性激活，这可能解释了特定UPR标志基因的选择性调控。尽管如此，我们的结果证实了肝细胞中的时钟可调控UPR转录本的振荡，且在肝细胞中敲低调控NaR产生的酶(NT5C2)会导致脂肪细胞中UPR表达的改变。这些观察结果表明NaR在UPR标志基因节律性表达中发挥作用。然而，重要的是要注意敲低NT5C2仅导致条件培养基中NaR的小幅减少，且该酶可能还参与调节其他贡献于脂肪细胞UPR的代谢物。NaR与其他UPR调控因子在不同细胞类型和物种间的相互作用尚需进一步研究。

我们的PISA分析表明NaR会破坏预折叠蛋白复合物的稳定性，但这种去稳定化的功能后果仍有待完全阐明。预折叠蛋白传统上被视为一种组成性分子伴侣，负责将新生或部分折叠的蛋白质递送至下游折叠机器。然而，预折叠蛋白复合物的去稳定化可能反直觉地增加其功能灵活性，例如通过促进亚基交换、瞬时解聚或改变底物特异性。在此模型中，NaR诱导的去稳定化可能使预折叠蛋白在合成代谢需求增加时更具包容性地结合未折叠或易聚集蛋白质，从而促进适应性蛋白质稳态而非损害它。这种机制与我们观察到的NaR处理后选择性诱导UPR相关基因程序是一致的，且没有明显蛋白质毒性应激的证据。此外，我们的研究中一个看似反直觉的观察是Pfdn6敲低减弱而非增强了UPR相关基因表达。直觉上，分子伴侣组分的丧失可能预期会增加未折叠蛋白的负担，从而激活应激通路。一种可能的解释是，完整的预折叠蛋白复合物不仅需要缓冲错误折叠的蛋白质，还需要产生激活适应性UPR转录程序所必需的特异性蛋白质稳态信号。在此视角下，预折叠蛋白可能作为折叠中间体的传感器，位于UPR信号传导上游，其丧失可能削弱细胞协调转录反应的能力。另一种可能是，慢性预折叠蛋白缺乏可能使细胞进入蛋白质稳态适应状态，从而抑制可诱导的UPR信号，降低对NaR等额外输入的应答性。尽管如此，我们证实了Pfdn6在调节脂肪细胞UPR中发挥关键作用。

我们观察到NaR诱导神经元但非肌管中的UPR相关基因表达，这表明NaR作为一种系统性信号，其细胞解读具有上下文依赖性。虽然NaR足以诱导神经元和脂肪细胞中Xbp1的表达，但肌肉细胞可能还需要额外的信号，即运动及其相关的PGC-1α参与。尽管如此，这些发现支持了一个模型，即NaR发挥双重系统性作用：作为贡献于肾脏烟酰胺生产的代谢底物，以及作为在特定靶组织激活蛋白质稳态通路的信号分子。

我们的发现强调了在代谢研究中考虑时间-日期和信号时间结构的重要性，这一原则在生理系统中日益受到认可。依赖静态遗传或药理学扰动的经典实验方法往往忽视代谢调控的动态特性，因此可能无法捕捉生理或病理生理调控的关键方面。在此背景下，我们的数据阐明了UPR在脂肪生物学中的双重作用，调和了此前关于UPR信号在不同背景下既可支持又可抑制脂肪细胞分化的观察。具体而言，我们的结果表明振荡式NaR信号促进支持脂肪细胞脂质积累的适应性UPR相关程序，而持续性NaR暴露则激活与高效脂质沉积不相容的状态。虽然NaR的急性反应并不直接激活脂肪生成转录程序，但我们提出，UPR调控的反复振荡可能是脂肪生成承诺过程中复杂机制所必需的。NaR急性处理后其他脂肪生成因子未发生变化与这一机制相符，即NaR通过预折叠蛋白复合物调控UPR，且正是UPR的瞬时激活而非持续性转录程序驱动脂肪生成承诺。鉴于这种时间和机制上的特异性，下游脂肪生成调控因子不一定会在急性处理的时间范围内发生变化。此外，我们的PISA分析表明NaR既与预折叠蛋白复合物相互作用，也直接与CEBPA结合，表明NaR在激活脂质代谢过程中产生协调响应。重要的是，我们提出这些相互作用可能是协同发生的，因为Cebpa mRNA表达仅在预折叠蛋白亚基Pfdn6存在的情况下NaR处理时被诱导。

这些机制在高热量条件下可能同样适用，因为我们的数据显示，肝细胞时钟对于小脂肪细胞群的扩张是必需的，这可能反映了新分化脂肪细胞的募集。NaR信号传导和未折叠蛋白反应（UPR）在肥胖发展过程中参与脂肪组织重塑的时间窗口仍需在后续研究中确定。这些发现凸显了协调的时间动态作为代谢信号解释的关键决定因素，并表明靶向代谢通路的策略可能受益于对分子过程波动的考虑，以更好地理解稳态调节。

本研究中观察到的NaR节律性和促脂肪生成效应表明，其生理作用超出了NAD+生物合成，还包括对细胞应激反应和脂质储存的时间依赖性调节。值得注意的是，循环NaR水平随年龄下降的报道，提出了NaR节律性丧失可能导致与年龄相关的代谢僵硬或脂肪组织功能障碍的可能性。在此背景下，NaR信号传导时间结构的改变，而非仅绝对代谢物丰度的变化，可能代表代谢衰老中被忽视的一个组成部分。虽然仍需进一步工作来确定这些机制的体内相关性，但我们的发现为探索恢复NaR节律性或NaR暴露的时间对齐是否能改善代谢稳健性提供了机制性见解。未来旨在在昼夜节律紊乱或衰老模型中测试时间分辨NaR干预的研究，将有助于确定该通路的潜在治疗价值。

**研究局限性**

首先，尽管蛋白质组学稳定性分析（PISA）、裂解液检测和分子对接分析支持NaR与预折叠蛋白亚基之间存在相互作用，但我们尚未进行直接的生物物理结合测量来定量定义NaR-预折叠蛋白的结合亲和力。其次，虽然我们证明了NaR在多种细胞类型中诱导UPR相关基因表达，但决定下游转录和功能反应的组织特异性因素仍需进一步研究。在脂肪细胞中，使用药物抑制剂和siRNA处理的实验提示ATF6在介导NaR诱导UPR和脂质积累中发挥作用。然而，不能完全排除药物化合物的脱靶效应。此外，虽然我们的体内昼夜节律代谢组学确立了NaR为肝钟调控的循环代谢物，但我们尚未在体内直接操纵全身NaR节律性来测试其对脂肪生理的因果效应。未来采用时间控制NaR给药或在体内遗传扰动预折叠蛋白的研究将有助于确定该信号轴的生理后果。最后，NaR的物种依赖性反应使我们无法判断其对UPR的影响在小鼠和人类脂肪细胞中是否通过相同的底层机制介导，且这些效应在人体内的相关性仍不明确。

尽管存在这些局限性，我们的发现建立了一个将全身昼夜节律信号传导与代谢物依赖的细胞稳态调控联系起来的机制框架，凸显了振荡性与线性分子过程之间的相互作用。

**资源可用性**

**主要联系人**

有关进一步信息和资源的请求应提交给主要联系人Paul Petrus（[e-mail]），由其负责处理。

**材料可用性**

本研究未产生新的独特试剂。

**数据和代码可用性**

- RNA-seq数据已存于GEO，登录号为GSE320452（NaR滴定）和GSE333546（3T3-L1条件培养基处理）。蛋白质组学数据已存于ProteomeXchange联盟（https://www.proteomexchange.org/），通过MassIVE合作存储库（https://massive.ucsd.edu/），MassIVE数据集标识符为MSV000100889，ProteomeXchange标识符为PXD074620。
- 本文未报告原创代码。
- 数据分析所用所有软件均为公开可用，并列举于关键资源表中。重新分析本文报告数据所需的任何其他信息均可向主要联系人索取。

**致谢**

我们感谢卡罗林斯卡学院弗伦明斯伯格校区单细胞测序核心设施（SICOF）提供的服务。该设施由卡罗林斯卡学院基础设施委员会支持。我们感谢卡罗林斯卡学院小分子质谱核心设施（KI-SMMS）提供的科学输入和样品代谢组学分析，该设施由卡罗林斯卡学院基础设施委员会资助。我们感谢卡罗林斯卡学院组织学核心设施提供脂肪组织样品的切片和成像服务。我们感谢瑞士巴塞尔大学Biozentrum蛋白质组学核心设施进行蛋白质组学样品的协作分析。此外，我们感谢Anna Krook教授和Nicholas Pillon博士慷慨提供3T3-L1和C2C12细胞系。我们还要感谢Mikael Ryden教授和Niklas Mejhert博士慷慨提供人类脂肪细胞系。最后，我们感谢Novo Nordisk基金会（NNF22OC0073101）、卡罗林斯卡学院、瑞典研究委员会（202302700）、Wenner-Gren基金会（FT2022-0001）、?ke Wiberg基金会和Jeanssons Stiftelser（J2023-0136）为Paul Petrus博士提供的财政支持。A.A.S.感谢Novo Nordisk基金会（NNF25OC0100921）和瑞典研究委员会（2023-02692）的资金支持。

**作者贡献**

P.P.和I.V.构思了项目并撰写了初稿。所有作者均审阅并批准了最终版本。I.V.、C.S.、L.Z.、A.A.S.和D.R.进行了实验和数据分析。P.P.、A.A.S.和A.S.为研究争取了资金。

**利益声明**

作者声明无利益冲突。

**生成式人工智能和人工智能辅助技术声明**

在本工作准备过程中，作者使用了Claude或ChatGPT等工具来改善稿件的语法和语言。作者对输出内容进行了审阅和编辑，并承担已发表文章内容的全部责任。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| anti-CEBP | Cell Signaling | Cat#8178; RRID: AB_11178517 |
| anti-ATF4 | Cell Signaling | Cat#11815; RRID: AB_2616025 |
| anti-XBP1s | Cell Signaling | Cat#40435; RRID: AB_2891025 |
| anti-ATF6 | Novus Biologicals | Cat#40256; RRID: AB_2058774 |
| anti-alpha-TUBULIN | Cell Signaling | Cat#9099; RRID: AB_10695471 |
| anti-P84 | Genetex | Cat#GTX70220; RRID: AB_372637 |
| Rabbit IgG-HRP | Sigma-Aldrich | Cat#A9169; RRID: AB_258434 |
| Mouse IgG-HRP | Sigma-Aldrich | Cat#5278; RRID: AB_258232 |
| **生物样本** | | |
| 小鼠骨骼肌，C57BL/6 | 本研究 | N/A |
| 小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT），C57BL/6 | 本研究 | N/A |
| 小鼠脑组织，C57BL/6 | 本研究 | N/A |
| **化学物质、多肽和重组蛋白** | | |
| DharmaFECT 1 转染试剂 | Horizon Discovery | Cat#T-2001-02 |
| DMEM 1.0g/L葡萄糖 w/o L-Gln | Lonza | Cat#12-707F |
| SYBR-green Master Mix | Bio-Rad | Cat#1708884 |
| Amersham ECL Prime 西方印迹检测试剂 | GE Healthcare | Cat#RPN2232 |
| Blotto 免疫分析级（非脂奶粉） | BioNordika | Cat#B501-0500 |
| DTT | Sigma-Aldrich | Cat#10197777001 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | Cat#M3148-100ML |
| RIPA缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | Cat#89901 |
| FGF2 人源 | Sigma-Aldrich | Cat#F0291 |
| 胰岛素（液体即用，10mg/mL，5mL） | Sigma-Aldrich | Cat#I9278 |
| T3 | Sigma-Aldrich | Cat#T6397 |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | Cat#T8158 |
| IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）- 用于人细胞系 | Sigma-Aldrich | Cat#I5879 |
| 罗格列酮（100 mg） | Cayman Chemicals | Cat#71740 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | Cat#D1756 |
| IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）- 用于小鼠细胞系 | Sigma-Aldrich | Cat#7018 |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | Cat#I6634 |
| 0.5% Trypsin/EDTA（10x） | Invitrogen (GIBCO) | Cat#15400-054 |
| 青霉素G 10000U/mL / 链霉素 10000μg/mL | Invitrogen (GIBCO) | Cat#15140-122 |
| HEPES 1M | Invitrogen (GIBCO) | Cat#15630-056 |
| Ham's F-12营养混合物 | Invitrogen (GIBCO) | Cat#21765-037 |
| DMEM低葡萄糖、丙酮酸（+谷氨酰胺） | Invitrogen (GIBCO) | Cat#31885-023 |
| 4x Laemmli 样本缓冲液 | Bio-Rad | Cat#1610747 |
| Bodipy 493/503 | Thermo Fisher Scientific | Cat#D3922 |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | Cat#34580 |
| Precision Plus 蓝色标记蛋白标准品 10-250kDa | Bio-Rad | Cat#1610373 |
| Complete 无EDTA蛋白酶抑制剂混合液，玻璃瓶中片剂 | Sigma-Aldrich | Cat#5056489001 |
| PhosSTOP | Sigma-Aldrich | Cat#4906837001 |
| QIAzol 裂解试剂 | Qiagen | Cat#79306 |
| DMEM/F12, HEPES | Invitrogen (GIBCO) | Cat#11330032 |
| 供体牛血清，新西兰产 | Invitrogen (GIBCO) | Cat#16030074 |
| 胎牛血清 | Invitrogen (GIBCO) | Cat#A52567011 |
| 1X磷酸盐缓冲生理盐水，pH 7.4 | Invitrogen (GIBCO) | Cat#10010023 |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Invitrogen (GIBCO) | Cat#15240062 |
| DMEM - 高葡萄糖 | Sigma-Aldrich | Cat#D6429 |
| L-谷氨酰胺溶液 200 mM | Sigma-Aldrich | Cat#59202C |
| 烟酸核糖苷 - 用于细胞 | Toronto Research Chemicals Inc. | Cat#TRC-N429400 |
| 烟酸核糖苷 - 用于灌胃 | AmBeed | Cat#17720-18-2 |
| β-烟酰胺单核苷酸（NMN） | Sigma-Aldrich | Cat #N3501 |
| 氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | Cat #S8776 |
| 4μ8C | Sigma-Aldrich | Cat#SML0949C |
| eapin-A7 | Sigma-Aldrich | Cat#SML2330G |
| GSK2656157 | Sigma-Aldrich | Cat#17372 |
| 曲柔霉素（来自链霉菌属） | Sigma-Aldrich | Cat#T7765 |
| 含Tween?的TBS（TBST），20X溶液，分子生物学级，超纯 | Thermo Fisher Scientific | Cat#J77500.1K |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | Cat#I1149 |
| 赖氨酸末端酶MS | Wako Chemicals | Cat#125-05061 |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | Cat#1000291000 |
| 羟胺 | Sigma-Aldrich | Cat#159417 |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat#85124 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100X） | Thermo Fisher Scientific | Cat#414000456 |
| 0%高脂饮食 | Ssniff Spezialdi?ten GmbH | Cat#D12492 |
| **关键商业检测** | | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | Cat#170-8891 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Cat#23227 |
| NucleoSpin RNA Mini试剂盒，用于RNA纯化 | Macherey-Nagel | Cat#32–740955.250 |
| Cell Counting Kit-8 | MedChemExpress | Cat#HY-K0301 |
| RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒 | Qiagen | Cat#74804 |
| 不锈钢微球，5 mm（200颗） | Qiagen | Cat#69989 |
| **已存数据** | | |
| NaR滴定测序 | 本研究 | GSE320452 |
| 条件培养基测序 | 本研究 | GSE333546 |
| 脂肪细胞蛋白质组学原始和处理数据 | 本研究 | ProteomeXchange: PXD074620; MassIVE: MSV000100889 |
| **实验模型：细胞系** | | |
| 3T3-L1 | Anna Krook实验室提供 | N/A |
| HT-22 | Milipore Sigma | Cat#SCC129 |
| C2C12 | Anna Krook实验室提供 | N/A |
| 人类前脂肪细胞 | Ryden/Mejhert实验室提供 | N/A |
| AML12 | 自产 | N/A |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| C57BL/6 Bmal1-lox+/+, Cre?/?（WT） | 自产 | N/A |
| C57BL/6 Bmal1-lox+/+, Cre+/?（LKO） | 自产 | N/A |
| **寡核苷酸** | | |
| siGENOME 非靶向siRNA池 #1 | Dharmacon | Cat#D-001206-13-05 |
| siGENOME 小鼠Atf6 siRNA SMARTpool | Dharmacon | Cat#M-044894-01-0010 |
| siGENOME 小鼠Pfdn6 siRNA SMARTpool | Dharmacon | Cat#M-048892-01-0010 |
| siGENOME 小鼠Nt5c2 siRNA SMARTpool | Dharmacon | Cat#M-061029-01-0010 |
| 人和小鼠qRT-PCR引物序列 | 本研究 | 见附表S6 |
| **软件和算法** | | |
| GraphPad Prism | v.11.0.0 | N/A |
| R Studio | v.4.1.1 | N/A |
| SpectroMine | Biognosis AG | N/A |
| PrankWeb | Biognosis AG | N/A |
| SwissDock Web服务器 | 洛桑大学分子建模组和SIB瑞士生物信息学研究所 | N/A |
| SpectroMine软件 | Biognosis AG, Schlieren, Switzerland | N/A |
| ImageJ/Fiji | v.1.54 | N/A |
| Adiposoft | v.1.16 | N/A |
| SafeQuant | Ahrné et al. | https://github.com/eahrne/SafeQuant.git |

**实验模型和实验对象详情**

**动物**

小鼠在瑞典卡罗林斯卡学院的动物设施中繁殖和饲养。本研究描述的所有动物实验和程序均经斯德哥尔摩南区伦理审查委员会批准（编号：02936–2023），并按照卡罗林斯卡学院的指南进行。肝细胞特异性BMAL1基因敲除小鼠（LKO）及其相应的野生型同胞鼠在C57BL/6J背景上构建，方法如前所述。所有实验使用10-12周龄雄性小鼠，采用12小时光照/12小时黑暗循环，并自由摄取常规饲料或高脂饲料。喂食高脂饲料（HFD）的小鼠接受脂肪占总热量60%的饮食9周。对于急性口服给药NaR，野生型和LKO小鼠在ZT12（约上午6:00，开灯时间为上午6点至下午6点）以生理盐水溶解的NaR（162.4 mg/kg）口服给药。4小时后在ZT16（约上午10:00）收集器官。所有器官迅速冷冻于液氮中，并在-80°C储存以供进一步处理。

**细胞研究**

本研究使用的细胞系均定期检测支原体污染，确认为阴性。细胞系的鉴定未在实验室进行确认。

**小鼠3T3-L1脂肪细胞系的培养与分化**

3T3-L1细胞如前所述进行培养。细胞生长于含10%供体小牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1X青霉素-链霉素溶液和3151 mg/L D-葡萄糖的DMEM/F12生长培养基中。当细胞达到90%汇合度时，用1X磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）洗涤，并暴露于含10%胎牛血清、3151 mg/L D-葡萄糖、100 μM IBMX、1 μM地塞米松、1.75 nM牛胰岛素和10 μM罗格列酮的DMEM/F12分化培养基中。启动分化3天后，去除培养基并更换为含1.75 nM胰岛素的分化培养基，再培养2天。之后每隔一天更换一次培养基。

**小鼠C2C12肌肉细胞系的培养**

如前所述，C2C12肌细胞在含10%胎牛血清、4.5 g/L葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和1%抗生素-抗真菌剂溶液的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。在细胞完全汇合后，通过将生长培养基中的胎牛血清替换为2%马血清来诱导肌源性分化。NaR处理实验在分化5天后进行。

**小鼠HT-22海马神经元细胞系的培养**

HT-22细胞按照供应商方案培养于含10%胎牛血清、1X L-谷氨酰胺和1X青霉素-链霉素溶液的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基中。细胞在24孔培养板中培养。当细胞达到90%汇合度后，用100 μM NaR处理6小时，随后提取RNA。

**小鼠AML12肝细胞系的培养**

AML12细胞如前所述进行培养。简要地，细胞在含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基/F-12营养混合物、HEPES、100 U/mL青霉素/链霉素、1%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液和40 ng/mL地塞米松的生长培养基中培养。细胞生长至90%汇合度。

**人类多能脂肪来源干细胞（hMADS）的培养**

体外分化的人类脂肪细胞由CD55+祖细胞分化而来，培养方法如所描述。细胞在含10% FBS、10 mM HEPES、50 μg/mL青霉素-链霉素和2.5 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF）的DMEM中维持。在约90%汇合度时，去除FGF，细胞再培养一天后启动分化。分化诱导持续3天，使用含5 mg/mL胰岛素、0.25 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX和10 mmol/L罗格列酮的成脂肪诱导混合物。在分化第3天，用100 μM NaR处理细胞6小时，随后裂解细胞进行RNA和蛋白质分析。

**方法详情**

**饲喂高脂饲料的肝细胞特异性Bmal1-KO小鼠的代谢表型**

饲喂普通饲料的肝细胞特异性Bmal1敲除（LKO）和野生型（WT）小鼠的代谢表型分析我们此前已报道。在本研究中，相应分析在饲喂60%高脂饲料的小鼠中进行。在9周饮食干预结束时，动物被单独安置于PhenoMaster代谢笼（TSE Systems）中，在22°C、50%相对湿度和12:12小时光照-黑暗循环的受控条件下进行。将小鼠放入代谢笼前测量总体重。笼位在各基因型之间平衡分配，以最小化笼位位置的潜在影响。代谢参数每10分钟连续监测一次。前48小时获得的测量值视为适应期的一部分，不纳入后续分析。运动活性、能量消耗、呼吸交换率和食物摄入量汇总为每小时平均值。

使用Microsoft Excel和Prism 10.1（GraphPad）进行数据处理和统计分析。细胞处理：在分化诱导后第三天，3T3-L1细胞分别用10 nM至100 μM的不同浓度NaR（包括10 nM、10 nM和100 μM）以及100 μM β-烟酰胺单核苷酸（NMN）处理1小时和6小时。对照组细胞用分化和培养液及水进行处理，因为NaR和β-NMN均溶解于无DNase/RNase水中。随后，细胞用含有2-巯基乙醇的裂解缓冲液裂解，并立即储存在-20°C直至进一步处理。

为评估NaR对脂质积累的持续效应，细胞在100 μM NaR中分化培养8天。对于脉冲处理方案，细胞每天仅暴露于NaR 8小时，随后用分化培养基洗涤并暴露于不含NaR的新鲜培养基中。对照组细胞同样处理但不暴露于NaR。所有实验均在分化诱导后第8天进行。

在分化诱导后第3天，用内质网应激诱导剂硫氨糖（5 ng/mL）处理24小时，用UPR各分支的抑制剂处理6小时：4-苯丁酸（64 μmol/L）、Ceqin-A7（4.7 μmol/L）和GSK2656157（5 μmol/L）。所有浓度均基于已发表研究的结果选择。

3T3-L1小鼠脂肪细胞的反转染：在分化开始前一天，对3T3-L1前脂肪细胞进行反转染。转染培养基由Pure DMEM培养基、siRNA（非靶标对照、PFDN6和ATF6；最终浓度40 nM）和DharmaFECT 1配制而成。然后将混合物铺板并在室温下孵育30分钟，再加入以增殖培养基重悬、浓度为250个细胞/μL的细胞。24小时后，用1× PBS洗涤细胞一次，并添加分化诱导剂。

RNA分离、cDNA合成和实时qPCR：按照制造商说明，使用商品化试剂盒（MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG；RNeasy Lipid Tissue Mini Kit）从细胞和动物组织中提取RNA。使用Nanodrop 2000测量浓度、质量和纯度。从细胞中提取的300 ng RNA和组织中提取的800 ng RNA使用iScript cDNA合成试剂盒进行逆转录。使用CFX384 Touch Real-Time PCR检测系统和SYBR Green Master Mix进行定量实时PCR（qRT-PCR）分析。所用qRT-PCR引物列表见表S6。

AML12条件培养基实验：将AML12细胞反转染非靶标对照siRNA或siNT5C2 siRNA，以每孔100,000个细胞的密度接种于24孔板中。次日，将转染培养基替换为含1.75 nM胰岛素的3T3-L1细胞分化培养基，继续在细胞上培养24小时。从每组收集400 μL条件培养基，置于1.5 mL Eppendorf管中，立即在液氮中速冻并在-80°C储存直至进一步处理。

为研究肝脏NaR对脂肪细胞UPR反应的直接贡献，在分化诱导后第三天，3T3-L1细胞用PBS洗涤后，与来自siC或siNT5C2 AML12细胞的条件培养基共培养6小时。含有1.75 nM胰岛素但未与肝细胞接触但暴露于细胞培养箱条件（37°C，5% CO2）的未使用3T3-L1分化培养基作为内部对照。

RNA测序：使用Smart-seq3方法（如前所述），对来自AML12 WT和AML12 Bmal1-KO条件培养基处理的3T3-L1细胞以及用10 nM、10 nM和100 μM NaR处理1小时和6小时的3T3-L1细胞样本进行测序。原始Fastq文件使用zUMIs（v2.4.1或更高版本）和STAR（v2.5.4b）进行处理以生成表达谱。使用zUMIs以指定模式和定义识别含UMI的reads。小鼠cDNA映射至mm10基因组，并使用CAST SNP屏蔽以避免偏差。使用Ensembl GRCm38.91注释进行数据量化。

蛋白质提取、定量、凝胶电泳和Western blot：接种于6孔板中的细胞在冰上使用补充了蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液进行裂解。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒估算蛋白质浓度。样品稀释以标准化体积和浓度，随后在95°C下变性5分钟，加入4X Laemmli缓冲液和2-巯基乙醇。蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离并转至硝酸纤维素膜上。膜在封闭试剂中（Amersham ECL Prime封闭溶液3%溶于Tris缓冲盐溶液-Tween 20（TBS-Tween））中孵育1小时，然后在4°C过夜孵育一抗。用TBS-Tween洗涤三次（每次10分钟）后，膜在室温下用含二抗的3%封闭溶液孵育1小时。膜与ECL Western blot底物孵育，使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories）采集图像。

脂质面积评估：3T3-L1前脂肪细胞接种于Corning CellBIND 96孔板中，直至达到90%汇合度。此后，细胞接受连续或8小时脉冲NaR处理方案，持续8天。然后用4%多聚甲醛在板上固定15分钟，用Hoechst和BODIPY染色20分钟，随后保存在PBS中。使用CellInsight CX5高通量筛选平台在10倍放大倍数下进行核（Hoechst）和脂质（BODIPY）染色的高通量定量。

细胞活力测定：3T3-L1脂肪细胞以每孔0.5×10?个细胞接种于96孔板中。分化诱导后第三天，细胞用不同化合物处理4小时。按照制造商说明使用Cell Counting Kit-8评估细胞活力。具体而言，在培养基中加入10 μL CCK-8溶液并孵育2小时。使用570 nm参考波长测定450 nm波长处的吸光度。每孔代表一个独立的生物学重复。吸光度值经空白校正并标准化为同一实验中未处理对照孔的平均值，后者设为100%活力。

靶向代谢组学分析：分化诱导后第三天，3T3-L1细胞分别用100 μM β-NMN或NaR处理1、2、4和6小时，用冰冷的甲醇裂解并立即在液氮中速冻。将管储存在-80°C直至分析。分析当天，将管涡旋5秒，随后在冰冷水浴超声中进行声处理。然后将样品再涡旋5秒并在8°C下以12,000×g离心15分钟。最后，将200 μL上清液转移至装有300 μL内衬管的琥珀色LC-MS样品瓶中供后续分析。表S1提供了检测到的化合物汇总，其中极性化合物的值以曲线下面积（任意单位，A.U.）表示，NaR的值以每颗粒物的纳克浓度表示。

蛋白质完整性溶解度改变（PISA）实验：PISA实验如前所述进行。简要而言，3T3-L1细胞在T175细胞培养瓶中培养并分化。在分化第3天，用100 μM NaR处理1小时。随后，细胞用预热1× PBS洗涤并在PBS中重悬。细胞悬液在液氮中进行5次冻融循环，然后在10,000×g下离心5分钟以去除细胞碎片。使用Pierce BCA测定法测量裂解物中的蛋白质浓度。将澄清裂解物分装为3个复孔，并在37°C下用350 μL反应体积中的NaR处理30分钟。反应后，将每个复孔的样品分装至96孔板的10个孔中，在Eppendorf梯度热循环仪（Eppendorf；Mastercycler X50s）中以48-59°C的温度范围加热3分钟。样品在室温下冷却3分钟，随后速冻并置于冰上。将每个复孔的样品合并并转移至聚碳酸酯厚壁管中，在4°C下以100,000×g离心20分钟。

将可溶性蛋白组分转移至新的Eppendorf管中。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测量所有样品的蛋白质浓度，从每个样品中转移相当于30 μg蛋白质的体积至新管中，加入尿素至最终浓度4 M。加入二硫苏糖醇（DTT）至最终浓度10 mM，样品在室温下孵育1小时。随后加入碘乙酰胺（IAA）至最终浓度50 mM，样品在室温避光条件下孵育1小时。通过加入额外的10 mM DTT终止反应。使用甲醇/氯仿沉淀蛋白质，并在含8M尿素的20 mM EPPS中重悬。随后使用EPPS将尿素稀释至4M，加入赖氨酸内切肽酶（质量比1:75），样品在室温下过夜孵育。使用EPPS将样品稀释至最终尿素浓度1M，加入胰蛋白酶（质量比1:75），随后在室温下孵育6小时。加入乙腈（ACN）至最终浓度20%，并向每个样品中加入4倍重量的TMT试剂（120 μg），随后在室温下孵育2小时。通过加入0.5%羟胺终止反应。将样品合并，用TFA酸化，使用Sep-Pak柱净化，并使用DNA 120 SpeedVac浓缩仪干燥。

在活细胞中进行PISA实验：细胞培养于6孔板中，密度为每板250,000个细胞。在分化第3天，用100 μM NaR处理1小时。随后细胞用PBS洗涤，刮取并在PBS中重悬。将样品分为10个等份于PCR板中并如上述加热，然后速冻并置于冰上。将每个复孔的样品合并，加入终浓度0.4%的NP40，随后进行三次冻融循环。其余步骤与裂解液中的PISA实验相同。

LC-MS/MS分析和数据采集：TMT标记的肽段使用XBridge Peptide BEH C18柱（3.5 μm，130 ?，1 mm × 150 mm，Waters）在Ultimate 3000 LC系统上进行高pH反相分离，流速为42 μL/min。肽段使用以下梯度分离：2% B到15% B持续3分钟，到45% B持续59分钟，到80% B持续3分钟，随后在80% B保持9分钟，然后回到2% B持续1分钟，最后在2% B保持15分钟。缓冲液A为水中的20 mM甲酸铵，pH 10；缓冲液B为90%乙腈中的20 mM甲酸铵，pH 10。总共收集72个馏分，使用如前所述的级联合并策略合并为24个馏分并在真空下干燥。

将干燥的肽段在0.1%甲酸水中重悬，并使用配备Vanquish Neo系统和自制柱加热器（设为60°C）的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪进行LC-MS/MS分析。肽段在自制RP-HPLC柱（75 μm × 30 cm）上用C18树脂（ReproSil Saphir 100 C18，1.5 μm，Dr. Maisch GmbH）分离，流速为0.2 μL/min。肽段使用以下梯度分离：2% B到8% B持续5分钟，到25% B持续70分钟，到35% B持续15分钟，到95% B持续1分钟，随后在95% B保持4.5分钟，然后回到2% B持续1分钟。缓冲液A为0.1%甲酸水，缓冲液B为水中的80%乙腈、0.1%甲酸。

质谱仪以DDA模式运行，主扫描之间循环时间为3秒。MS1光谱在Orbitrap中以120,000分辨率采集，扫描范围为400–1600 m/z，AGC目标设为"Standard"，最大注入时间设为"Auto"。前体离子过滤条件为：前体选择范围设为400–1600 m/z，单同位素峰确定设为"Peptide"，隔离窗口中心设为"Most Abundant Peak"，电荷状态设为2–6，动态排除60秒，前体拟合窗口为0.7 m/z内70%，强度阈值为2.5×10?。

用于 MS2 分析的前体离子在四极杆中以 0.7 m/z 的隔离窗口进行选择，并使用归一化碰撞能为 35% 的 HCD 进行碎裂。MS2 谱图在轨道阱中以质心模式采集，分辨率为 30,000，扫描范围模式设置为“定义第一质量”，第一质量为 110 m/z，归一化 AGC 目标设置为 200%，最大注入时间为 54 ms。获取的原始文件使用 SpectroMine 软件进行分析。谱图与包含 17085 条蛋白序列（2022 年 2 月 22 日从 UniProt 下载）和 392 种常见污染物的小鼠数据库进行比对。使用 TMT 16 pro 的标准 Pulsar 搜索设置（“TMTpro_Quantification”），并通过“导出报告”功能在 PSM 水平导出鉴定结果及对应的定量值。获取的报告离子强度用于使用内部开发的 SafeQuant R 脚本（v2.3）进行自动定量和统计分析（见关键资源表）。该分析包括报告离子强度的调整、通过平衡所有通道的报告离子总强度进行全局数据归一化、使用 knn 算法进行数据填充、按蛋白和通道对报告离子强度进行求和以及计算蛋白丰度比。为满足线性回归模型和 t 检验使用所依据的额外假设（正态性和方差齐性），蛋白的归一化强度从线性尺度转换为对数尺度。蛋白强度基于每个样本的总强度进行归一化，然后通过对蛋白强度进行 log2 转换和中心化，并通过 student t 检验和 Benjamini-Hochberg 调整计算折变化值和调整后的 p 值。

**附睾白色脂肪组织的 H&E 染色**

WT 和 LKO 小鼠在普通饲料或高脂饲料喂养 9 周后，其 WAT 样本在 4% 多聚甲醛（PFA）中固定 24 小时，进行脱水并处理为石蜡包埋。切片厚度为 5 μm，并使用标准程序进行苏木精和伊红（H&E）染色。使用 Evident SLIDEVIEW VS200 SILA 切片扫描系统在 20× 放大倍率下获取全玻片图像。使用 ImageJ 的 Adiposoft 插件估算脂肪细胞直径。对于每张切片，从组织的不同区域选择三个非重叠区域（全分辨率下 4500 × 4500 像素），避免褶皱、撕裂和染色伪影，并使用 Bio-Formats 的 crop-on-import 功能从全玻片扫描中裁剪。使用 Adiposoft 的自动模式量化脂肪细胞大小，直径检测范围为 15-200 μm，并通过对其三个成像区域中所有检测到的细胞进行平均，计算每只动物的平均脂肪细胞直径。

**Pfdn6 结构准备、口袋预测和分子对接**

所有小鼠和人类 PFDN 亚基的预测结构从 AlphaFold 获取。使用 PrankWeb 识别推定的配体结合口袋，PrankWeb 基于蛋白的结构和理化特征预测结合位点。选择排名最高的口袋进行进一步分析。

使用 SwissDock 进行分子对接，以评估预折叠蛋白与 NaR 之间潜在的相互作用。使用 PFDN1、2、5 和 6 的 AlphaFold 预测结构作为受体，使用 NaR 的 SMILES 表示（C1=CC(=C[N+](=C1)[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)CO)O)O)C(=O)[O-]）作为配体。使用默认参数进行对接，并基于估计的结合自由能和构象稳定性分析预测的结合模式。

**定量和统计分析**

**节律性和 Deseq2 分析**

使用 dryR 包识别血清和肝脏代谢组学以及 conditioned media 实验原始计数数据中的差异节律性，使用默认参数。dryR 函数实施基于广义线性模型的节律性分析，并随后使用贝叶斯信息准则进行模型选择。使用 Metabolon 为血清和肝脏样本提供的原始归一化数据，通过 dryR 包识别节律性代谢物。使用 CosinorOnline（https://cosinor.online/appNew/index.php）进一步验证肝脏和血清单个代谢物以及昼夜转录本的节律性。基因的置换法调整后 p 值 <0.05 时被认为具有显著昼夜节律性。

为了检测 3T3-L1 细胞经 1、10 和 100 μM NaR 处理后转录组数据中差异表达的基因，使用 DESeq2 包分析 Smart-seq3 计数数据。

**统计分析**

所有数据以均值 ± S.E.M. 表示。对于每个实验，生物学重复数、统计检验和显著性阈值可在图例中找到。除非另有说明，数据使用 Prism 10.1（GraphPad）和 R Studio 进行分析。

**补充信息（8）**
下载全部 PDF（5.77 MB）

文档 S1：图 S1–S6

电子表格（29.35 KB）
表 S1：经 NaR 处理的 3T3-L1 细胞的代谢组学数据
（A）原始和归一化的曲线下面积。
（B）分析的化合物信息

电子表格（4.64 MB）
表 S2：经 NaR 处理的 3T3-L1 细胞的 RNA 测序
（A）1 小时处理，1、10 和 100 μM NaR。
（B）6 小时处理，1、10 和 100 μM NaR。
（C）100 μM NaR 处理 6 小时后显著差异表达的基因

电子表格（8.09 MB）
表 S3：经同步的 AML12 细胞 conditioned media 处理的 3T3-L1 细胞 RNA 测序，并使用 DryR 分析

电子表格（1.81 MB）
表 S4：蛋白体整体溶解度改变（PISA）分析
（A）串联质量标签（TMT）混合图和温度。
（B）PISA 分析中经 NaR 处理的 3T3-L1 细胞的归一化 TMT 强度。
（C）PISA 分析中经 NaR 处理的 3T3-L1 细胞蛋白裂解液的归一化 TMT 强度

电子表格（13.24 KB）
表 S5：NaR-预折叠蛋白对接分析
（A）PrankWeb PFDN 配体结合口袋排名分数。
（B）NaR 和 PFDNs 的 AutoDock Vina 亲和力分数

电子表格（11.53 KB）
表 S6：qPCR 引物序列
（A）针对小鼠基因的引物序列。
（B）针对人类基因的引物序列

PDF（27.32 MB）
文档 S2：文章及补充信息