体内血脑屏障膜蛋白的空间分布受分选基序和生理信号调控

《Cell Reports》：Spatial distribution of blood-brain barrier membrane proteins is controlled by sorting motifs and physiological signals in vivo

　　

**Highlights**
•测量了脑内皮细胞腔面与非腔面膜蛋白的分布
•分选基序在体内促进非腔面富集
•休息和活跃期驱动 CD31 分布的空间变化

**Summary**
血脑屏障（BBB）由脑内皮细胞（BECs）形成，为大脑正常功能创造了一个安全和稳态的环境。尽管 BECs 极其薄，但其腔面和基膜面质膜面临截然不同的环境：分别是血液和脑实质。BBB 膜蛋白在这些膜之间的空间分布如何以及调控其定位的因素尚不清楚。在此，我们建立了一种在体内测量 BBB 极化蛋白分选的方法。我们表征了转运蛋白和受体在腔面和基膜面质膜上的分布，并鉴定了控制极化分选的蛋白内在基序。最后，我们观察到膜蛋白分布发生变化，与昼夜节律一致，揭示了 BBB 动力学中一个被低估的维度。该方法可广泛用于评估发育和疾病期间膜蛋白景观的变化，并为选择跨 BBB 治疗的最佳分子靶点提供依据。

**Graphical abstract**
图形摘要

**Introduction**
血脑屏障（BBB）是严格控制中心物质在血液和大脑之间分子转运的界面，以维持神经元健康和功能的稳态环境。内皮细胞形成血管的内衬，是 BBB 的解剖部位。除了控制细胞旁路和跨细胞转运外，脑内皮细胞（BECs）还表达多种转运蛋白，用于营养输送和废物清除。完整的 BBB 是中枢神经系统（CNS）药物递送的主要障碍，而在神经发育和神经退行性疾病中观察到 BBB 功能受损。因此，需要针对不同目的操纵屏障的治疗策略。这些策略取决于对 BECs 信号和转运途径的更深理解，这些途径由膜蛋白支配。

BECs 是极化的。它们拥有独特的面向血液、接触体液因子的腔面质膜，以及面向脑实质、与脑细胞和脑源性因子相互作用的基膜面质膜。BECs 面临的一个显著挑战是，它们的腔面和基膜面质膜必须在仅由微小距离隔开的情况下与这些不同环境相互作用；大部分 BEC 厚度仅为 200 纳米。BECs 部分通过其膜蛋白与这些不同环境相互作用。因此，将膜蛋白靶向到正确的位置可能对 BBB 完整性、营养输送和毒性物质清除至关重要。尽管近年来 BECs 的转录组学研究呈指数增长，列出了在 BECs 中高表达的独特基因列表，但这些蛋白如何空间分布却知之甚少。关于支配 BECs 极化膜蛋白分选的规则以及分子机制，了解的更少。

几个障碍限制了理解 BEC 膜蛋白空间分布的进展。首先，BECs 的薄尺寸挑战了光学显微镜的衍射极限。以前的方法主要依赖于免疫电镜，但很少有抗体与该方法兼容，且标记的性质极其稀疏，限制了其定量潜力。其次，周细胞和星形胶质细胞等邻近细胞在复杂的脑环境中与 BECs 紧密关联，阻碍了区分 BEC、周细胞或星形胶质细胞膜的能力。第三，BECs 的体内分析至关重要：在体外，BECs 迅速去分化，从大脑纯化后失去关键 BBB 蛋白的表达。

为了克服这些限制，我们开发了一种利用 BECs 独特解剖结构、超分辨率显微镜和新兴遗传工具的方法，以定量揭示体内 BECs 的腔面和基膜面蛋白分布。我们应用该方法测量了腔面和基膜面质膜上多种转运蛋白和受体的相对水平，鉴定了这些蛋白在不同程度上富集于每个表面的亚群。此外，我们鉴定了控制 BBB 膜蛋白极化分选的蛋白内在基序。最后，我们检查了白天和夜间膜蛋白的空间分布，并鉴定了 CD31 定位的变化，揭示了 BEC 动力学中一个惊人的方面。该方法具有广泛的应用前景，包括进一步理解基本的 BBB 细胞生物学、评估发育和疾病状态下膜蛋白分布的变化，以及洞察 BBB 治疗的最佳分子靶点。

**Results**
**Development of an approach to image and measure luminal-abluminal membrane protein distribution in BECs in vivo**
**开发一种在体内成像和测量 BECs 腔面 - 基膜面膜蛋白分布的方法**

我们着手测量体内蛋白在腔面和基膜面质膜之间的分布情况。分隔腔面和基膜面质膜的小距离使得它们难以通过光学显微镜分辨。然而，正如在电子显微镜下显而易见的那样，在内皮细胞核周围区域（图 1A），两个质膜之间的分隔距离可以通过受激发射耗竭超分辨率显微镜（STED）分辨。利用这一解剖特征，我们使用 STED 对小鼠脑切片中由不同膜蛋白抗体免疫染色的内皮细胞该区域进行成像。为了定量测量极化蛋白分布，在内皮核周围区域测量了腔面和基膜面质膜上的免疫荧光信号。然后，给定蛋白的基膜面富集度计算为平均基膜面强度除以平均腔面强度（>1 表示基膜面富集，1 表示分布相等，<1 表示腔面富集）。还计算了总蛋白中位于腔面或基膜面的百分比（图 1B）。

**Figure 1 A super-resolution strategy for measuring polarized protein sorting in brain endothelial cells in vivo**
**图 1 测量脑内皮细胞体内极化蛋白分选的超分辨率策略**
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(A) Electron micrograph of a mouse brain endothelial cell (BEC). The positions of the luminal plasma membrane (orange) and abluminal plasma membrane (blue) are indicated.
(A) 小鼠脑内皮细胞（BEC）的电镜照片。标示了腔面质膜（橙色）和基膜面质膜（蓝色）的位置。
(B) Schematic diagram illustrating the approach for measuring and calculating the percentage distribution at the luminal and abluminal plasma membrane and its abluminal enrichment.
(B) 示意图说明了测量和计算腔面及基膜面质膜百分比分布及其基膜面富集度的方法。
(C) STED image of AAV-BI30-transduced BEC expressing HA-tagged OAT3 co-stained with luminal plasma membrane marker PODXL. Left inset: abluminal membrane (Ab). Right inset: luminal membrane (Lu). Nucleus is labeled by DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole).
(C) 经 AAV-BI30 转导表达 HA 标签 OAT3 的 BEC 的 STED 图像，与共染腔面质膜标记物 PODXL。左插图为基膜面（Ab）。右插图为腔面（Lu）。细胞核由 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）标记。
(D) STED image of AAV-BI30-transduced BEC expressing an Alfa-tagged general plasma membrane marker (Alfa-PM) co-stained with PODXL.
(D) 经 AAV-BI30 转导表达 Alfa 标签通用质膜标记物（Alfa-PM）的 BEC 的 STED 图像，与共染 PODXL。
(E–G) Quantification of the percentage of HA-OAT3, PODXL, and Alfa-PM at the luminal and abluminal plasma membranes (mean ± SD). Data points are measurements from individual cells. Mean luminal and abluminal percentages are listed.
(E–G) HA-OAT3、PODXL 和 Alfa-PM 在腔面和基膜面质膜上百分比的定量（平均值 ± 标准差）。数据点为单个细胞的测量值。列出了平均腔面和基膜面百分比。
(H) HA-OAT3, PODXL, and Alfa-PM abluminal enrichments (mean ± 95% confidence interval). Mean abluminal enrichments are listed. Scale bars: 2 μm.
(H) HA-OAT3、PODXL 和 Alfa-PM 的基膜面富集度（平均值 ± 95% 置信区间）。列出了平均基膜面富集度。比例尺：2 μm。

我们开始使用此策略测量已知的腔面和基膜面蛋白，分别为巢蛋白（PODXL）和 OAT3。PODXL 是一种表达于足细胞顶端膜的细胞表面唾液酸黏蛋白。它也在包括大脑在内的多种器官的内皮中表达，并通过免疫电镜定位于腔面膜。的确，我们对 PODXL 分布的 STED 成像显示，其中 96.1% 位于腔面，基膜面富集度为 0.03（图 1C–1F 和 1H）。OAT3 是一种有机阴离子转运蛋白，据报道在大鼠脑中定位于内皮细胞基膜面。然而，在转录水平上，除了在 BECs 中高表达外，在大脑周细胞中也检测到了 OAT3 表达，这可能会混淆分析结果。此外，我们无法鉴定出用于小鼠免疫组化的 OAT3 特异性抗体。为了选择性地可视化和测量 BECs 中的 OAT3，我们使用 BI30 衣壳，一种全身递送且能有效转导小鼠中枢神经系统内皮细胞的腺相关病毒（AAV），在小鼠 BECs 体内表达 HA 标签的 OAT3（图 1C）。与 PODXL 相比，HA-OAT3 有 76.9% 位于基膜面，平均基膜面富集度为 2.77（图 1E–1H）。最后，我们设计了一个构建体，通过将 K-Ras 的 CAAX-box 膜靶向基序与用于检测的 Alfa 表位标签融合，非选择性地标记腔面和基膜面质膜，我们预期其在两个膜之间具有大致相等的分布。的确，该构建体有 55.5% 位于基膜面，基膜面富集度为 0.86（图 1D–1G 和 1H）。（由于沿基膜面的轨迹比腔面膜长，当两侧强度相似时，基膜面百分比略高于 50%。）这些结果证明了这一方法可以可靠地测量体内 BECs 中膜蛋白的分布。

**Spatial distribution of BEC membrane proteins in mouse and human**
**小鼠和人类 BEC 膜蛋白的空间分布**

接下来，我们使用该方法测量了一组 BEC 膜蛋白的空间分布，包括 BBB 富集的转运蛋白和受体，以及泛内皮膜蛋白。

一些蛋白主要定位于腔面膜。P-糖蛋白（P-gp）（98.2% 位于腔面，基膜面富集度 0.02），一种在 BECs 中高表达的蛋白，是一种广谱特异性 ATP 驱动泵，可将异生物和内源性激素从细胞中排出，限制其进入大脑（图 2A）。细胞间黏附分子 2（ICAM2）（86.5% 位于腔面，基膜面富集度 0.11）是内皮细胞中组成型表达的细胞黏附分子，与白细胞整合素相互作用（图 2B）。Basigin（79.1% 位于腔面，基膜面富集度 0.21）是免疫球蛋白超家族中的一种糖基化 I 型跨膜蛋白，在形成 BBB 的 BECs 中高表达（图 2C）。CD31（68.9% 位于腔面，基膜面富集度 0.39）是一种泛内皮膜蛋白，调节白细胞跨内皮迁移及其他过程（图 2D）。

**Figure 2 Membrane protein distribution in brain endothelial cells in vivo**
**图 2 脑内皮细胞体内膜蛋白分布**
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(A–L) STED images of the indicated proteins with and without DAPI to show the position of the nucleus. Scale bars: 2 μm.
(A–L) 所示蛋白质的 STED 图像，有无 DAPI 以显示细胞核位置。比例尺：2 μm。
(M) Abluminal enrichment for proteins in (A)–(L) (mean ± 95% confidence interval). Data points are measurements from individual cells. Proteins were categorized as luminally enriched (teal) or abluminally enriched (pink) if their log-transformed abluminal enrichments differed significantly from the non-targeted control, Alfa-PM, by nested ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test; p values indicated.
(M) (A)–(L) 中蛋白质的基膜面富集度（平均值 ± 95% 置信区间）。数据点为单个细胞的测量值。如果其对数转换的基膜面富集度与未靶向对照 Alfa-PM 相比，通过带有 Dunnett 多重比较检验的嵌套 ANOVA 显示显著差异，则蛋白质被归类为腔面富集（青色）或基膜面富集（粉色）；标示 p 值。
(N) Summary table of the mean abluminal percentages of the proteins in (A)–(L).
(N) (A)–(L) 中蛋白质平均基膜面百分比汇总表。

一些蛋白在腔面和基膜面质膜之间显示出更均匀的分布。Mfsd2a（66.8% 位于腔面，基膜面富集度 0.37）是一种不饱和磷脂转运蛋白，是 omega-3 脂肪酸运入大脑所必需的，并维持 BECs 独特的脂质组成，抑制小窝介导的跨细胞运输（图 2E）。葡萄糖转运蛋白 GLUT1（53.9% 位于基膜面，基膜面富集度 0.76）在 BECs 中高表达，负责将葡萄糖运入大脑（图 2F）。转铁蛋白受体（TfR）（55.6% 位于基膜面，基膜面富集度 1.05）也在 BECs 中高表达，对铁的运入大脑至关重要，并且是将治疗药物递送入大脑的主要靶点（图 2G）。小窝蛋白 1（Cav1）（69.4% 位于基膜面，基膜面富集度 1.82）是一种膜支架蛋白，是小窝囊泡形成所必需的，并调节 T 细胞跨 BBB 转运（图 2H）。

某些蛋白显示出基膜面富集。BECs 表达 I 类主要组织相容性复合体（MHC I）蛋白，这是一组关键的免疫系统受体。MHC I 基膜面富集度为 3.07（79.5% 位于基膜面）（图 2I）。整合素是介导细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质黏附的异二聚体跨膜蛋白；删除某些 EC 表达的整合素会导致 BBB 缺陷。整合素α6（81.8% 位于基膜面，基膜面富集度 3.97）是层黏连蛋白的受体（图 2J）。整合素β1 显示出 4.97 的基膜面富集度（79.7% 位于基膜面）（图 2K）。有趣的是，一种识别整合素β1 活性构象的抗体在基膜面质膜上显示出进一步的富集（基膜面富集度 16.76，93.7% 位于基膜面）（图 2L）。

对于一些基膜面富集的蛋白，脑组织成像的一个潜在并发症是 BECs 与周细胞和星形胶质细胞足端形成紧密接触。在我们检查的蛋白中，整合素α6 在星形胶质细胞中在转录水平上被检测到（低于 BECs 水平），而整合素β1 在周细胞中高表达。由于这可能会混淆我们的测量结果，我们修改了方法或对这些蛋白进行了额外成像（见方法；图 S1）。

鉴于 BBB 的治疗和疾病相关性，我们测试了我们的方法是否可以应用于人类脑组织样本。使用尸检脑组织，我们发现 GLUT1 在人类 BECs 的腔面和基膜面之间显示出大致相等的分布（图 2A 和 2D）。Cav1 也容易在两个膜上检测到，尽管比 GLUT1 略微更多地富集于基膜面（图 S2B 和 2D）。相比之下，PODXL 比 GLUT1 和 Cav1 表现出更显著的腔面富集分布（图 S2C 和 S2D）。

因此，通过该方法可以在人类脑样本中测量人脑内皮细胞（BECs）的极性以及不同的膜蛋白分布。总体而言，我们观察到了广泛谱系的蛋白分布（图2M和2N；表S4）。为了帮助对这些不同分布进行分类，我们在统计学上比较了此前测量的各蛋白的脑外膜侧富集程度与对照非靶向质膜标记物Alfa-PM之间的差异。脑外膜侧富集程度与Alfa-PM存在显著差异的蛋白被归类为管腔侧富集（P-gp、PODXL、ICAM2、basigin和CD31）或脑外膜侧富集（HA-OAT3、MHC I、整合素α6、整合素β1和活化整合素β1）。脑外膜侧富集程度与Alfa-PM无显著差异的蛋白被归类为非极性化（Mfsd2a、GLUT1、TfR和Cav1）（图2M）。重要的是，这一分类体系应被视为一个连续谱而非绝对分类，反映的是在所检验的样本量下与非极性化对照之间可检测到的差异。例如，Mfsd2a和CD31表现出相似的脑外膜侧富集程度，其p值分别为0.0639和0.0320，恰好位于显著性阈值的两侧。总之，这些结果表明BECs中存在强大的分选程序，可产生稳定的管腔侧或脑外膜侧富集，并提示BECs中可能存在多种多样的分选机制。

蛋白内在基序调控血脑屏障膜蛋白的 localization

我们进一步探讨了决定BECs中极性化蛋白分布的因素。关于极性化膜蛋白分选机制的已知信息，大多来源于培养的上皮细胞中顶-基底侧分选以及培养的神经元中胞体-树突-轴突分选的研究。虽然顶侧分选决定因子往往较为模糊，但某些基底侧和胞体-树突分选决定因子是明确的，即跨膜蛋白胞质结构域中特定的氨基酸序列。此类分选信号包括YXX?和[DE]XXXL[LI]，其中氨基酸以其单字母缩写表示，X代表任何氨基酸，?代表一种体积较大的疏水氨基酸。这些基序被适配蛋白复合物识别，后者为异四聚体，既可与这些序列相互作用，也可与包被蛋白相互作用，从而将货物选择与囊泡形成偶联，促进含基序的货物蛋白的基底侧/胞体-树突分选。这些基序是否调控BECs中的极性化蛋白分布目前尚不清楚。为了鉴定BECs表达的蛋白中的候选分选基序，我们计算搜索了15,813个BECs表达基因，基于其跨膜结构域的存在及拓扑结构进行筛选，以鉴定其胞质区域中的YXX?和[DE]XXXL[LI]序列（表S3）。这一生物信息学方法产生了一份含有潜在分选基序的膜蛋白列表，这些基序可能促进脑外膜侧富集。其中一个YPTV基序在OAT3中被发现（图3A）。为了检验该序列是否确实是OAT3靶向脑外膜侧的决定因素，我们构建了Y437A/V440E突变体，并通过BI30 AAV在BECs中体内表达HA标记的野生型和突变型OAT3（图3B）。引人注目的是，Y437A/V440E突变体中HA-OAT3的脑外膜侧富集丧失，该突变体在管腔侧和脑外膜侧质膜之间大致均匀分布（图3B、3C和3D）。

图3 酪氨酸基分选基序促进脑外膜侧质膜富集

(A) OAT3拓扑结构及其酪氨酸437和缬氨酸440位置示意图。(B) 表达HA标记的野生型或Y437A/V440E突变型OAT3的AAV-BI30转导BECs的STED图像。标尺：2 μm。(C) 野生型和突变型OAT3的脑外膜侧（Ab）和管腔侧（Lu）百分比（均值±标准差）。标注了嵌套t检验的p值。(D) 野生型和突变型OAT3的脑外膜侧富集程度（均值±95%置信区间）。嵌套t检验。(E) MHC I的酪氨酸342位置示意图。(F) 表达HA标记的野生型或Y342A突变型MHC I的AAV BI30转导BECs的STED图像。标尺：2 μm。(G) 野生型和突变型MHC I的脑外膜侧和管腔侧百分比（均值±标准差）；嵌套t检验。(H) 野生型和Y432A突变型MHC I的脑外膜侧富集程度（均值±95%置信区间）；嵌套t检验。

另一种脑外膜侧富集的蛋白MHC I在其胞质结构域中含有一个保守的酪氨酸残基（图3E）。尽管YALA序列并非典型的YXX?基序，但已有研究证实其在树突状细胞中可介导与适配蛋白复合物-1的相互作用。我们通过BI30 AAV表达HA标记的野生型或Y342A突变型MHC I，以检验该酪氨酸残基在MHC I脑外膜侧富集中的作用（图3F）。Y342A突变型HA-MHC I丧失了HA-MHC I的脑外膜侧富集，在两侧质膜之间呈大致均等的分布（图3F、3G和3H）。因此，酪氨酸基基序是促进BECs脑外膜侧富集的关键分选信号。

由于标记蛋白的过表达有时会影响力其定位，我们评估了通过BI30表达的HA标记野生型MHC I是否与内源性MHC I具有相似的定位。比较两者的脑外膜侧富集程度后发现，两组之间无显著差异（图S3A），这支持了HA标记野生型MHC I表现出与内源性蛋白相当的定位这一结论。

膜蛋白的突变可能导致其错误折叠并滞留在内质网（ER）中。为了检验突变体的定位改变是否反映了内质网滞留，我们使用了来自细胞色素p450的成熟内质网靶向序列，将其与Alfa表位标签融合，并通过BI30病毒表达该构建体，使我们能够在体内标记BECs的内质网（图S3B）。BECs中的内质网在细胞核周围表现出强烈的富集，而野生型和突变型OAT3及MHC I则无此分布（图S3C）。因此，OAT3和MHC I突变体定位的变化并不反映内质网滞留，表明蛋白内在分选基序在体内调控BECs的脑外膜侧定位。

外在因素调节膜蛋白的空间分布

鉴于BECs在血脑屏障通透性和转运功能中的动态特性正逐渐被认识，我们询问蛋白分布是否可能在不同生理状态下受到动态调控，尤其是在心血管功能存在昼夜差异的背景下。例如，血压具有昼夜节律性，急性心血管事件（如心肌梗死、猝死或中风）的发生最常出现在早晨时段。血脑屏障处亦观察到外排转运的昼夜变化。与早晨相比，傍晚时段血-视网膜屏障通透性增加。为检验该假设，我们测量了分别在早晨（小鼠休息期，时间标记[ZT] 2）和夜间（小鼠活动期，ZT14）收获的鼠标脑中的膜蛋白分布。CD31显著地从早晨在管腔侧和脑外膜侧质膜之间的近乎均等分布，转变为夜间偏向管腔侧富集的分布（图4A和4B）。相比之下，GLUT1（图4C和4D）、ICAM2（图4E和4F）、PODXL（图4G和4H）和Cav1（图4I和4J）未发生显著变化。这些结果表明，跨膜蛋白在管腔侧和脑外膜侧表面之间的空间分布可受到动态调控，这可能有助于解释在各种生理和疾病状态下观察到的血脑屏障通透性和转运功能变化。此外，了解血脑屏障膜蛋白的相对空间分布以及改变这种分布的条件，对于开发靶向管腔侧膜蛋白以穿越血脑屏障的治疗药物至关重要。因此，这种体内空间分布方法可用于多种应用。

图4 昼夜蛋白分布比较

(A、C、E、G和I) 小鼠休息期（早晨，ZT2）或活动期（夜间，ZT14）收获的鼠标脑中各指定蛋白的STED图像。标尺：2 μm。(B、D、F、H和J) 各指定蛋白在休息期和活动期的脑外膜侧富集程度图（均值±95%置信区间）。标注了平均脑外膜侧富集值。嵌套单向方差分析配合Bonferroni多重比较检验；标注了p值。

讨论

在本研究中，我们提出了一种在体内测量血脑屏障膜蛋白空间分布的方法。由于膜蛋白调控BECs生物学的根本方面并代表重要的治疗靶点，确定其定位于BECs的管腔侧或脑外膜侧可推进对血脑屏障转运和信号传导的理解，并指导药物递送候选受体的可行性评估。此类测量必须在体内进行，因为BECs在从脑分离并体外培养时会发生广泛的转录谱变化并丧失血脑屏障特性；同时，常用的血脑屏障模型缺乏关键的血管内皮特征。结合超分辨率成像技术和最新开发的基因工具，我们揭示了跨膜蛋白内在的基序，这些基序决定了它们在BECs中的定位，并证明血脑屏障蛋白空间分布也可在不同生理条件下受外在因素动态调控。这些结果开辟了新的研究途径，探讨血脑屏障与其环境的相互作用，这在以往是无法实现的。

我们在OAT3和MHC I中鉴定了促进脑外膜侧靶向的基序，阐明了BECs用于产生不同膜蛋白分布的分选机制之一。管腔侧富集蛋白可能依赖于多种多样的决定因子；在上皮细胞中，顶侧分选决定因子比用于基底侧分选的离散氨基酸序列更为模糊。顶侧蛋白的生物物理特征，包括胞质结构域大小以及对更紧密排列的顶侧脂质环境的偏好，已被证实参与其分选。理解BECs中管腔侧蛋白分选机制是一个重要的未来方向，因为管腔侧膜是血脑屏障与血液之间交流的主要位点，因此是大脑-机体轴的主要界面。最终，这一研究方向可能允许预测蛋白在血脑屏障的空间定位，指导旨在修饰或操控该屏障的工具开发。

脑微环境调控BECs的特性，包括基因表达和血脑屏障通透性。我们的方法也可用于研究这一微环境的作用，包括神经血管单元中其他细胞对BECs蛋白定位的影响。IV型胶原α1链和PODXL在周细胞缺失小鼠模型中发现定位正常，表明周细胞的缺失并未导致极性的普遍丧失。然而，周细胞或其他脑细胞可能提供影响特定转运体和受体空间分布的线索，例如通过调节分选通路实现。

了解BECs中膜蛋白分布对药物向脑的递送具有重要意义。BECs膜蛋白已被用于一种穿越血脑屏障的策略，将治疗药物与从血液转运入脑的内源性分子一同穿梭。转铁蛋白受体（TfR）是这种方法的主要靶点，即将TfR结合抗体与治疗药物偶联以递送至脑内。Basigin也被用作脑递送的靶点，方式类似。目前仍在努力鉴定可增强治疗药物脑递送的血脑屏障受体。候选受体的定位可能是评估潜在靶点的一个有用特征，除此之外还有许多其他因素需要考虑。例如，高度管腔侧富集将使受体更丰富地存在于静脉给药后可被抗体结合的位置，但可能提示转胞吞作用有限。该方法获取人样本数据的能力（图S2）对这类研究尤为重要。该方法还可用于检查神经疾病背景下脑血管内皮极性的潜在变化，以及理解与疾病相关的血脑屏障转运过程。血管性痴呆是第二常见的痴呆类型，而癫痫、多发性硬化症、胶质母细胞瘤和阿尔茨海默病等则关键性地涉及神经血管功能障碍的各个方面。在阿尔茨海默病中，P-gp和其他血管内皮转运体参与Aβ清除；在癫痫中，已观察到糖代谢改变和GLUT1水平变化。将这些观察结果与转运体和受体极性信息相结合，因此可推进对疾病中神经血管功能障碍的理解。

我们对CD31昼夜分布可变性的意外观察表明，血脑屏障处蛋白定位并非纯粹静态，也非仅由蛋白内在因素决定；相反，管腔侧和脑外膜侧之间的分布可在生理变化下游发生偏移。CD31定位的这一变化为未来研究开辟了新的问题和机遇。具体而言，涉及CD31的问题包括调节其定位偏移的分子因素以及昼夜间血管适应性变化的功能意义。

CD31是一种免疫球蛋白超家族中的泛内皮细胞黏附和信号分子，同时也表达于血小板和白细胞中。由于CD31是一种机械敏感性蛋白，其定位的改变可能与血压的昼夜节律变化有关。同时，CD31表面表达水平会影响其形成同亲性相互作用的倾向，从而可能进一步增强脑内皮细胞（BECs）与免疫细胞之间不同形式的相互作用。

更广泛地说，我们的发现与一种日益受到认可的观念相呼应，即血脑屏障（BBB）是一个动态界面，其功能在不同生理状态下进行适应性调节。例如，禁食会增加单羧酸转运体MCT1的表达，而将小鼠换成高脂饮食会暂时降低脑葡萄糖摄取和GLUT1水平，这表明BBB会对代谢变化做出反应。昼夜节律与BBB外排转运的变化有关，P-gp转录水平在小鼠活跃期（夜间）达到峰值，这被认为是一种节能机制，也可能被利用于药物递送策略。尽管这些及其他BBB变化令人瞩目，但对潜在机制的探索在很大程度上局限于转录本或蛋白总水平的变化。本文所述方法将允许研究者探索BEC对代谢变化、昼夜节律、神经活动和其他生理状态反应的一个新维度：膜蛋白空间分布的变化，而这些变化反过来可能深刻影响BBB处的信号传导和转运。

研究局限性
我们发现酪氨酸基序调节非腔面定位。然而，在识别与这些基序相互作用的下游转运机制方面仍存在空白，这是未来工作的重要方向。基于上皮细胞的平行性，适配蛋白复合物是颇有前景的候选对象。同样，虽然我们观察到蛋白质分布存在昼夜节律性变化，但驱动这些变化的机制及其生理相关性仍有待确定。

另一项局限性在于，该方法仅在细胞核周围区域进行测量，且尚未正式证明该区域能够代表整个细胞表面。有两个因素支持该区域能够代表整个细胞表面。首先，质膜的核区与非核区之间不存在扩散屏障。在内皮细胞中，紧密连接是腔面与非腔面质膜之间的扩散屏障；同样，上皮细胞中的紧密连接也会在上皮侧和基底外侧域之间形成扩散屏障。然而，没有任何已知或明显的结构特征能在内皮质膜的核区与非核区之间形成此类屏障。其次，在某些情况下，在细胞不环绕核的区域，腔面和非腔面质膜可以部分分离（图S4A和S4B）。这在人类样本中最为明显，可能是因为它们的尺寸更大。在人类样本的非核区域，GLUT1可见于腔面和非腔面质膜，而PODXL局限于腔面质膜，这与核区域所观察到的一致（图S4C和S4D）。未来对该方法的改进，可能结合扩展显微镜、3D STED以及腔面和非腔面质膜的自动追踪技术，将有助于测量更大的内皮细胞表面区域。未来的工作还需要确定其他血管方向对该方法测量可靠性的影响程度。

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致谢
我们感谢Gu实验室所有成员提供的宝贵建议和讨论。我们感谢Jonathan Cohen、Trevor Krolak和Layla Nassar对本稿件提出的建设性反馈。本工作得到T32癌症神经科学培训资助（5T32CA272386，J.A.）和美国国家神经疾病与中风研究所（R35NS116820，C.G.）的支持；C.G.是霍华德休斯医学研究所的研究员。

作者贡献
J.A.和C.G.构思了研究并设计了实验。J.A.、C.G.和S. Bhandarkar撰写了手稿，所有作者均有贡献。J.A.、S. Bhandarkar和S. Boloker执行了实验。J.A.和S. Bhandarkar进行了分析。S. Bhandarkar进行了潜在基序的计算分析。D.R.W.获取了人类样本并为手稿提供了建议。S. Bhandarkar、J.A.和Y.D.L.进行了AAV质粒设计、克隆和验证。

利益声明
作者声明不存在竞争利益。

STAR★方法
关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
抗体
兔抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | Cat#3724S；克隆：C29F4；RRID：AB_1549585
大鼠抗小鼠PODXL抗体 | R&D systems | Cat#MAB1556；RRID：AB_2166010
兔抗GLUT1抗体 | Sigma-Aldrich | Cat#07-1401；RRID：AB_1587074
兔抗GLUT1 AF488抗体 | Sigma-Aldrich | Cat#07-1401-AF488；RRID：AB_1587074
大鼠抗转铁蛋白受体抗体 | Novus Biologicals | Cat#NB100-64979；克隆：8D3；Novus Cat# NB100-64979，RRID：AB_962622
兔抗Caveolin-1抗体 | Cell Signaling Technology | Cat#3267S；RRID：AB_2275453
山羊抗CD31抗体 | R&D systems | Cat#AF3628；RRID：AB_2161028
兔抗Mfsd2a抗体 | Gu实验室 | N/A
山羊抗Basigin抗体 | R&D systems | Cat#AF772；RRID：AB_355588
大鼠抗ICAM2抗体 | BD Pharmingen | Cat#553326；克隆：3C4(mIC2/4)；RRID：AB_394784
小鼠抗P-gp AF594偶联抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Cat#sc-55510 AF594；RRID：AB_629007
大鼠抗MHC I抗体 | BMA Biomedicals | Cat#T-2105；克隆：ER-HR52；RRID：AB_1227429
大鼠抗整合素α6抗体 | BioLegend | Cat#313602；RRID：AB_345296
大鼠抗整合素β1抗体 | Millipore Sigma | Cat#MAB1997；RRID：AB_2128202
大鼠抗活化整合素β1抗体 | BD Pharmingen | Cat#553715；RRID：AB_395001
抗ALFA兔FC融合蛋白 | NanoTag Biotechnologies | Cat#N1583；RRID：AB_3075998
山羊抗CD13抗体 | R&D systems | Cat#AF2335；RRID：AB_2227288
山羊抗人PODXL抗体 | R&D systems | Cat#AF1658；RRID：AB_354920
兔抗水通道蛋白-4抗体 | Chemicon | Cat#AB3594；RRID：AB_91530
山羊抗大鼠IgG STAR RED | Abberior GmBH | Cat#STRED-1007；RRID：AB_2910106
山羊抗兔IgG STAR ORANGE | Abberior GmBH | Cat#STORANGE-1002；RRID：AB_3068622
山羊抗兔IgG STAR RED | Abberior GmBH | Cat#STRED-1002；RRID：AB_2833015
驴抗山羊IgG STAR RED | Abberior GmBH | Cat#STRED-1055；RRID：AB_2861383
驴抗大鼠IgG AF594 | Jackson ImmunoResearch | Cat#112-585-003；RRID：AB_2338372
驴抗兔IgG AF594 | Invitrogen | Cat#A-21207；RRID：AB_141637

细菌和病毒株
AAV-BI30：CAG HA-OAT3 miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A
AAV-BI30：CAG HA-OAT3 Y437A/V440E miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A
AAV-BI30：CAG HA-MHC I (H2K1) miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A
AAV-BI30：CAG HA-MHC I (H2K1) Y342A miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A
AAV-BI30：CAG ER-Alfa miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A
AAV-BI30：CAG Alfa-质膜 miR122 WPRE pA | 本研究/Janelia病毒工具团队 | N/A

已存档数据
用于鉴定小鼠膜蛋白胞质区潜在酪氨酸基（YXXΦ）和双亮氨酸（[D/E]XXLL）分选基序的自定义代码。 | 本研究/Github | Zenodo：https://doi.org/10.5281/zenodo.22664199

实验模型：生物体/品系
C57BL/6J | Jackson实验室 | 品系 000664；RRID：IMSR_JAX:000664

寡核苷酸
合成DNA片段序列；见附表S1 | Integrated DNA Technologies或Twist Bioscience | N/A

重组DNA
pAAV-CAG-SV40NLSf-GFP-3xmiR122-WPRE-HGHpA | Addgene | Cat#183775

软件和算法
(Fiji is Just) ImageJ (v. 153t) | 美国国家卫生研究院 | https://fiji.sc/
Lightbox (2024.48.21878-gc86bbd647c) | Abberior GMBH | N/A
MATLAB (2023b版) | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html
GraphPad Prism (9.4.0版) | GraphPad | https://www.graphpad.com

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实验模型和受试者详情

动物
所有程序均已获哈佛 institutional 动物护理和使用委员会（IACUC协议# IS00000045-9）批准，并符合相关监管标准。小鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗的循环中。本研究使用了商业可获得的水合氯化钠溶液维持的C57BL/6J（Jackson实验室000664）小鼠。本研究中使用了雌雄混合的小鼠；未观察到性别特异性效应。数据收集自8-16周龄的成年小鼠。

人类样本
本研究中用于的去标识化死后脑组织在尸检时从布里格姆与妇女医院获取，符合马萨诸塞州总医院布里格姆人体研究保护计划（IRB协议#2015P001388，D.R.W）。IRB批准了对去标识化死后组织使用的知情同意豁免。人脑组织样本通过尸检从内侧颞叶皮层获取。样本收集的排除标准包括：死亡时的感染、神经疾病的临床证据以及异常的脑部影像学检查（CT或脑部MRI）。所有对照样本的死亡原因均为心肺骤停。所有纳入本研究的样本从死亡到组织处理的时间间隔均少于24小时。样本量为三人，死亡时年龄分别为36岁、54岁和67岁，均为男性。因此，无法考察性别对这些数据的影响。

方法细节

克隆与AAV递送
用于病毒递送HA-OAT3、HA-MHC I（野生型和突变体）、Alfa-质膜和ER-Alfa的质粒制作如下。基因片段的设计基于OAT3（UniProt：O88909）或MHC I（基因H2-K1，Uniprot：P04223）的小鼠序列。对于Alfa-tag质膜构建体，质膜标记通过融合蛋白实现，该融合蛋白由N端的SNAP-tag组成，随后是GSGSGS连接肽，接着是三拷贝的Alfa表位标签、GSGSGS连接肽，C端为来自K-Ras 2B亚型（UniProt：P01116-2）的CAAX-box膜靶向序列。对于ER-Alfa构建体，细胞色素p450 2C1（Uniprot：P00180）的内质网靶向序列置于N端，随后是GSGSGS连接肽，C端为四拷贝的Alfa标签。这些基因片段由Integrated DNA Technologies（IDT）或Twist Bioscience订购。这些基因片段的序列包含在附表S1中。每个片段通过Gibson组装（NEB E2611S）连接到pAAV-CAG-SV40NLSf-GFP-3xmiR122-WPRE-HGHpA（Addgene #183775）骨架上，使用KpnI（NEB R3142S）和EcoRI（NEB R3101S）限制性位点。定制腺相关病毒（AAV）由Janelia病毒工具团队生产。AAV通过尾静脉注射静脉给予成年小鼠，剂量为1×1012病毒基因组。给药后10天收集大脑进行分析。

免疫组织化学
小鼠通过腹腔注射含PBS的氯胺酮（10 mg/mL）/赛拉嗪（2 mg/mL）进行深度麻醉，按体重13 μL/g给药。10分钟后，在确认无脚趾夹反应后，使用蠕动泵以3 mL/min的流速进行心脏灌注，灌注液为10 mL冰冷4%多聚甲醛（PFA）、1% PFA或PBS（根据抗体染色优化的组织固定条件，见附表S2）。大脑在4% PFA、1% PFA或甲醇中后固定2小时或4°C过夜，轻柔摇动。样品随后用PBS洗涤以去除残留的PFA或甲醇。对于冷冻切片，样品在4°C的15%蔗糖溶液中冷冻保存过夜直至下沉，随后在4°C的30%蔗糖溶液中过夜直至下沉。大脑沿中线纵向切开以获得矢状切片。每个半球在NEG-50（Richard-Allan Scientific 6502）中冷冻，并在Leica CM3050 S冷冻切片机上切成30μm薄片。非昼夜节律实验的样本在下午1:30至8:30之间收集。

切片用PBS洗涤去除NEG-50，在0.3% PBST（Triton X-100，Sigma-Aldrich T8787-50ML）中通透10分钟，然后用5%正常驴血清（Jackson Immunoresearch，017-000-121）/0.3% PBST溶液室温封闭1小时。切片随后在封闭溶液中与稀释的一抗4°C孵育过夜，用PBS洗涤3次，然后在封闭溶液中与稀释的二抗4°C孵育过夜。本研究中使用的一抗和二抗列于附表S2中。

对于抗P-gp抗体，通透步骤替换为使用Trypsin-EDTA在室温下进行3分钟抗原修复（Fisher Scientific 25-200-114），PBS洗涤，在补充了1%青霉素/链霉素（Thermo Fisher 15140122）和10%胎牛血清（R&D Systems S11150）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Thermo Fisher 11995065）中短暂（<5分钟）孵育，封闭前进行最后一次PBS洗涤。

对于抗CD13抗体，使用了不同的封闭缓冲液——切片在PBS中的1% BSA、2% Triton-X中4°C封闭过夜。切片随后在封闭溶液中与稀释的一抗4°C孵育2天，用PBS洗涤3次，然后在封闭溶液中与稀释的二抗4°C孵育1天。

最后，切片用PBS洗涤3次，并用1 mg/mL DAPI储备液以1:5000稀释于PBS中（Thermo Fisher Scientific，62247）短暂孵育（4分钟）。对于人脑样本，在上述方案后增加了一个步骤以减少自发荧光：将0.3%苏丹黑B（Sigma-Aldrich，199664-25g）溶于70%乙醇的溶液加入组织切片中5分钟，随后用PBS充分洗涤。

载玻片封片（VVR 48393-241）并用ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂（ThermoFisher Scientific，P36934）封片后进行成像。

图像采集
代表性荧光图像使用Abberior GMBH Lightbox软件（2024.48.21878-gc86bbd647c）在搭载Abberior GmBH Facility Line STED显微镜的倒置Olympus IX83机身上采集。该系统配备405 nm、485 nm、561 nm和640 nm激发激光以及脉冲式775 nm STED消耗激光。

本研究使用了60倍油浸物镜。

**成像用激光和滤光片组合的选择**

对于每个样品，一个膜标记物使用远红染料（640 nm激发波长）进行可视化，另一个使用红色或橙色染料（561 nm激发波长）进行可视化。对于需要第三个通道的图像，使用绿色染料（488 nm激发波长）。成像前，通过Lightbox软件选择相应的染料（以及DAPI）。

**STED成像设置**

本研究中的图像采用二维STED。STED激光的激发功率是共聚焦所用功率的2-3倍。小鼠组织中STED标记物的激光功率设定为10%。在人组织中，设定为3-4%。具体波长功率范围为1-50%，取决于抗体强度和成像通道（即，远红通道的蛋白质需要更低的功率）。对于部分图像，使用了能够分别测量背景信号和STED信号从而最小化噪声的MATRIX检测器。所有图像的像素驻留时间为10-12.5 μs，像素尺寸为20-30 nm。在成像和分析步骤中，重要的是监测管腔面或基底面信号在整个核区域是否存在涂抹现象，因为这可能表明z轴污染，从而影响测量的可靠性。

**图像量化**

我们将用于测量上皮细胞和神经元中极性蛋白分选的方法改良应用于内皮细胞环境。图像分析在ImageJ/Fiji中进行。使用宽度为25像素的自由手绘线追踪脑内皮细胞（BEC）的基底面和管腔面。对于仅表达于其中一个膜上的标记物，使用共染标记物作为另一个膜的参考。使用测量工具确定轨迹线的平均像素强度和长度。

使用了两种方法来量化蛋白分布：基底面和管腔面百分比，以及基底面富集分数，后者改编自先前描述的极性指数。

**基底面和管腔面信号百分比**

基底面/管腔面信号计算为平均基底面/管腔面强度与沿各自膜的轨迹线长度的乘积。总信号为基底面和管腔面信号之和。基底面和管腔面信号百分比计算如下：

基底面信号百分比 = 基底面信号 / 总信号 × 100

管腔面信号百分比 = 管腔面信号 / 总信号 × 100

**基底面富集分数**

基底面富集分数计算如下：

基底面富集 = 平均基底面强度 / 平均管腔面强度

**针对除BEC外还表达于周细胞或星形胶质细胞的蛋白质的改良方法**

对于周细胞表达的蛋白，大脑同时染色整合素β1或活性整合素β1、周细胞标记物CD13以及BEC标记物GLUT1（图S1A和S1B）。随后测量基底面上缺乏周细胞覆盖的区域，从而能够测量BEC特异性信号（图S1C）。以下步骤用于区分仅BEC的Itgb1或活性Itgb1信号：1) 渲染包含所有3个通道的复合图像。2) 在基底面上，在GLUT1与整合素β1/活性整合素β1重叠且无周细胞（Cd13）信号的区域绘制单条或多条轨迹线。3) 将这些轨迹线保存在兴趣区域管理器中。4) 使用GLUT1作为参考绘制管腔面轨迹线。

为了确定整合素α6是否除在BEC外还定位于星形胶质细胞足突，我们用整合素α6和星形胶质细胞足突标记物水通道蛋白-4对大脑进行共染，或用整合素α6和BEC标记物GLUT1进行共染（图S1D和S1F）。在星形胶质细胞足突和BEC可以清楚区分的区域，我们没有检测到水通道蛋白-4与整合素α6之间的重叠（图S1D和S1E）。相比之下，我们检测到了GLUT1与整合素α6之间的重叠（图S1F和S1G）。这些结果与整合素α6在BEC中表达但不表达于星形胶质细胞足突一致。

**图像处理**

图像首先在Lightbox软件中进行后期处理。对于使用MATRIX检测器拍摄的图像，添加反卷积→矩阵滤波器。对于使用STED损耗激光拍摄的其他图像，添加反卷积→强度滤波器。其他后期处理（如亮度/对比度调整）在ImageJ/Fiji中进行。

**透射电子显微镜**

将野生型小鼠如上所述麻醉，然后用含5%戊二醛（Electron Microscopy Sciences, 16220）、4% PFA（Electron Microscopy Sciences, 15713-S）、0.4g/mL氯化钙（Sigma, C7902）的0.1 M醋酸钠（Electron Microscopy Sciences, 11653）溶液进行灌注。解剖后，大脑用相同固定剂在室温下后固定1小时。随后大脑在4°C下用0.1 M醋酸钠中的4% PFA固定过夜。固定后，大脑在0.1 M醋酸钠中洗涤4次，每次5分钟。然后用振动切片机将大脑切成200 μm厚的自由漂浮切片。切片在1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾中后固定，并在环氧树脂中脱水和包埋。随后从包块表面切取超薄切片（80 nm），收集在铜网上，用柠檬酸铅染色，并在配备2k CCD数码相机（AMT）的1200EX电子显微镜（JEOL）下检查。电子显微镜服务和成像在HMS电子显微镜设施完成。

**BEC表达的膜蛋白中潜在分选基序的计算搜索**

我们从scRNA-seq数据集中获得了15,813个鼠源的BEC表达数据。基因名称映射到UniProt中的蛋白质信息，包括氨基酸序列、长度、跨膜和拓扑域，以及亚细胞定位。聚焦于至少有一个跨膜域且注释为细胞膜定位的蛋白质，将该集合缩小至1,861个基因。随后，我们筛选胞质域中的YXX?和[DE]XXXL[LI]基序（? = V、I、L、F或M），发现有1,061个基因含有YXX?，335个含有[DE]XXXL[LI]。检查人类同源蛋白的基序保守性，BEC表达中等至较高的基因中有883个含YXX?，237个含[DE]XXXL[LI]，218个同时含有两种基序。分析使用Python完成，采用numpy、pandas和正则表达式操作。含有推定基序的蛋白质列表见附表S3。该分析的代码可在以下链接获取：https://github.com/gulabneuro/mouse-human-sorting-motifs 和 https://doi.org/10.5281/zenodo.22664199。

**昼夜测量**

小鼠在ZT2（上午9点）或ZT14（晚上9点）麻醉，然后如上所述进行灌注并处理进行免疫组织化学。图像采集、处理和量化如上所述进行，由对组织采集时间盲法的实验者完成。在其他实验中，实验者对实验组别或蛋白身份不盲法。

**量化和统计分析**

除非另有说明，数据使用GraphPad Prism 9.4.0软件进行分析，具体统计检验方法在图注中指定。平均基底面富集分数、百分比和置信区间列于附表S4。蛋白分布的样本量列于下方。PODXL：5只小鼠（分别测量18、17、17、18和10个细胞）。野生型HA-OAT3：4只小鼠（13、10、13和8个细胞）。Alfa-Plasma Membrane：3只小鼠（10、10和11个细胞）。P-gp：3只小鼠（16、10和10个细胞）。ICAM2：4只小鼠（10、10、10和10个细胞）。Basigin：5只小鼠（9、10、10、10和10个细胞）。CD31：4只小鼠（10、10、10和10个细胞）。Mfsd2a：4只小鼠（11、10、10和10个细胞）。GLUT1：3只小鼠（11、10和10个细胞）。TfR：4只小鼠（8、10、10和10个细胞）。Cav1：3只小鼠（10、10和10个细胞）。内源性MHC I：5只小鼠（9、10、10、10和10个细胞）。整合素α6：3只小鼠（10、10和10个细胞）。整合素β1：3只小鼠（10、10和10个细胞）。活性整合素β1：3只小鼠（10、10和10个细胞）。HA-OAT3 Y437A/V440E：4只小鼠（18、7、10和8个细胞）。野生型HA-H2K1：4只小鼠（22、10、10和10个细胞）。HA-H2K1 Y342A：4只小鼠（15、10、10和10个细胞）。人类GLUT1样本：3个（10、13和10个细胞）。人类Cav1样本：3个（10、12和11个细胞）。人类PODXL样本：3个（10、10和11个细胞）。昼夜实验的样本量如下。CD31早晨：6只小鼠（每只10个细胞）。CD31夜晚：6只小鼠（每只10个细胞）。GLUT1早晨：6只小鼠（每只10个细胞）。GLUT1夜晚：6只小鼠（每只10个细胞）。ICAM2早晨：6只小鼠（每只10个细胞）。ICAM2夜晚：6只小鼠（每只10个细胞）。PODXL早晨：6只小鼠（每只10个细胞）。PODXL夜晚：6只小鼠（每只10个细胞）。Cav1早晨：6只小鼠（每只10个细胞）。Cav1夜晚：6只小鼠（每只10个细胞）。图2中的统计分析是对基底面富集分数进行对数转换后进行的；所有其他检验均对原始基底面富集分数进行。p值<0.05被视为具有统计学显著性。

作为图3中野生型与酪氨酸突变OAT3和MHC I比较的附加统计检验，我们使用MATLAB函数fitlme生成了一个线性混合效应模型，其中蛋白质（野生型或突变体）作为固定效应，动物作为随机效应。绝对值>2的t统计量通常被视为具有统计学显著性；我们获得的值以及p值<0.05，与酪氨酸基序突变对蛋白分布具有显著效应以及图3中嵌套t检验的结果一致。模型输出包含在附表S4中。

**补充信息（6）**

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文档S1. 图S1–S4
电子表格 (11.05 KB)
表S1. 通过Gibson组装克隆至pAAV-CAG-SV40NLSf-GFP-3xmiR122-WPRE-HGHpA向量的合成DNA片段序列
电子表格 (10.35 KB)
表S2. 使用的抗体汇总
电子表格 (428.12 KB)
表S3. 鼠源和人类同源蛋白中胞质域含有YXX?或[DE]XXXL[LI]序列的BEC表达蛋白质列表
电子表格 (14.68 KB)
表S4. 基底面富集值、百分比和线性混合效应模型输出
PDF (20.73 MB)
文档S2. 正文加补充信息