单细胞CRISPR筛选绘制人类造血干细胞与祖细胞中谱系特化及恶性转化的表观遗传调控图谱

《Cell Stem Cell》：Single-cell CRISPR screen maps epigenetic regulators of lineage specification and malignancies in human HSPCs

将遗传扰动如何影响细胞命运进行关联，是理解人类发育与疾病的核心。研究人员开发了原代人造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）中可大规模并行的单细胞CRISPR（single-cell CRISPR，scCRISPR）筛选平台，对322个调控因子在172,382个单扰动细胞中进行建模。所得多层调控框架既捕获已知关联，又实现调控因子—表型关系的功能性注释。该图谱显示，调控因子在扰动簇（perturbation clusters，PCs）中作用，驱动不同基因程序（gene programs，GPs）以塑造细胞命运。作为概念验证，SMYD3被认定为长期再生能力的负调控因子；谱系输出分析确定KMT5B、TRIM24、SETD7与NSD3为偏向性谱系输出相关调控因子。最后，与临床数据集整合将PRDM10提名为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）候选依赖性。本研究在原代人类干细胞系统中建立了可扩展功能基因组学平台。

研究背景方面，将基因型与表型关联是生物学基本问题，但在复杂原代人组织中从相关观察走向基因功能的因果理解仍具挑战。人造血系统由少量造血干/祖细胞（HSPCs）持续生成血液与免疫细胞，传统功能缺失研究多一次扰一个基因或检测群体平均信号，无法揭示调控机器内的协同效应；批量CRISPR筛选会掩盖异质细胞状态，单细胞转录组图谱缺乏直接功能证据。因此，亟需在原代干细胞系统中以单细胞分辨率系统性引入遗传扰动并捕获复杂表型结果。

该研究发表于《Cell Stem Cell》。研究人员在原代CD34⁺ HSPCs中优化慢病毒scCRISPR流程，以染色质调控因子为测试对象，构建大规模功能图谱，并进一步通过体内外实验、多组学整合与临床数据整合，揭示表观遗传调控因子如何控制造血干细胞自我更新、谱系定向及白血病依赖关系。

主要关键技术方法包括：使用来自多人脐带血供体的原代CD34⁺ HSPCs池；慢病毒sgRNA库递送后Cas9蛋白电穿孔；10x Genomics单细胞转录组测序；Monocle 2伪时间与RNA velocity轨迹重建；STRING蛋白互作网络注释；RNP靶向敲除验证；NOG与NCG-X小鼠异种移植评估长期重建与谱系输出；scATAC-seq与CUT&Tag多组学整合；MAGMA与scDRS整合髓系白血病GWAS；AML细胞系与限制性稀释分析评估白血病起始细胞频率。

研究结果如下。

scCRISPR筛选映射人类造血中的表观遗传调控：研究人员对335个表观遗传调控因子设计1005条sgRNA及100条非靶向对照，最终保留322个高置信基因。172,382个单扰动细胞经无偏聚类重现HSC/MPP、髓系、淋系、巨核红系等连续分化结构。各基因敲除平均改变大量下游基因，已知调控因子表型被复现，从而建立可扩展的功能图谱。

表观遗传调控因子以PCs形式运作并协调不同程序：研究人员将322个敲除基因与2519个靶基因构建调控网络，得到PC0–PC8与GP0–GP11。PCs通过激活或抑制特定GPs决定细胞身份，同一PC内调控因子更易存在物理互作，说明造血命运由协同或拮抗的调控集合控制。

SMYD3敲除赋予造血细胞长期重建优势：HSC富集亚群分析显示PC0负向约束原始状态。研究人员通过RNP敲除SMYD3，发现其增加体外CD34⁺细胞与集落输出，异种移植后外周血、脾脏、骨髓人CD45⁺嵌合率更高，二次移植与二次集落重铺仍增强，说明SMYD3是长期再植能力的负调控因子。

KMT5B与TRIM24分别调节髓系谱系平衡：KMT5B属PC2，敲除后CD14⁺单核细胞偏好增强；TRIM24属PC0，敲除后CD15⁺中性粒细胞偏好增强。CUT&Tag与scATAC-seq显示相应位点H4K20me2、H3K27ac及染色质可及性改变，体内骨髓分析支持相对髓系偏移。

SETD7与NSD3分别调节红系与巨核系输出：SETD7敲除富集红系亚群，CD235a⁺红系细胞增加；NSD3敲除富集巨核亚群，CD41a⁺巨核细胞与外周血小板增加。H3K4me1、H3K36me2及可及性变化分别与红系、巨核系程序一致。

PRDM10代表AML候选依赖性：研究人员将scCRISPR特征与髓系白血病GWAS整合，PRDM10经MAGMA与scDRS选出，且高表达预后更差。PRDM10属PC2，关联复制检查点与有丝分裂程序。在MOLM13-Cas9与NOMO1-Cas9细胞中敲除PRDM10抑制生长、诱导凋亡与细胞周期阻滞，体内移植延长生存并降低白血病起始细胞频率，DepMap中亦呈阴性Chronos评分。

讨论部分总结：造血由表观修饰因子构成的复杂网络控制，本研究用大规模scCRISPR在原代HSPCs中建立高分辨率功能图谱，核心组织原则是调控因子按PCs与GPs模块化作用，而非孤立表观标记。该框架缓解表观调控因子冗余与平行因子缓冲带来的表型遮蔽。研究也指出，transitional集群可能反映代谢压力或培养适应状态；文库为聚焦知识型面板，并非全部HSPC特异调控因子目录；体外培养无法完全模拟骨髓微环境，DC等谱系因细胞因子缺失而细胞数少；PRDM10虽在AML模型中有效，但是否区别于正常HSPC仍需比较。

研究结论部分翻译：造血由复杂调控网络控制，其中表观遗传修饰因子起关键作用。虽然基因组图谱已描述该景观，但对调控因子如何控制人造血的综合性因果理解仍缺失。本研究采用大规模并行scCRISPR筛选，构建原代人HSPCs中表观遗传调控因子的高分辨率功能图谱。该平台用于解构调控逻辑的价值体现在：研究人员将SMYD3确定为长期再植能力的负调控因子，确定四个与偏向性谱系输出相关的调控因子，并从功能上支持PRDM10作为AML候选依赖性。本工作基于并扩展了近期将遗传扰动与单细胞基因组学整合的研究。核心分析特征是根据功能读数将基因分组为离散PCs与GPs，这种模块化表明造血命运由协同蛋白复合物而非孤立表观标记控制，反映了写入器、阅读器与重塑剂之间的内在协同。该功能图谱还捕获了表观遗传调控因子的多效性。未来方向包括HSPC定制文库、单细胞DNA与RNA多组学、时间序列scCRISPR，以及克隆条形码和谱系追踪技术。总之，研究人员呈现了大规模单细胞转录组资源，广泛映射人造血谱系中表观遗传扰动的功能后果，并为解析原代人干细胞系统调控格局及提名造血疾病依赖性提供了可扩展框架。