《Animals》：Development and Application of an eDNA-Based MIRA-LFD Assay for the Detection of the Chinhai Spiny Newt
编辑推荐：
本研究建立了一种基于环境DNA（eDNA）结合多酶恒温快速扩增（MIRA）与侧向流试纸条（LFD）技术的可视化检测方法，用于中国特有珍稀两栖动物——镇海棘螈（Echinotriton chinhaiensis）的栖息地监测。研究人员选取特异性线粒体基因片段作为
本研究建立了一种基于环境DNA（eDNA）结合多酶恒温快速扩增（MIRA）与侧向流试纸条（LFD）技术的可视化检测方法，用于中国特有珍稀两栖动物——镇海棘螈（Echinotriton chinhaiensis）的栖息地监测。研究人员选取特异性线粒体基因片段作为靶标，通过与同域分布物种（包括鲫鱼、牛蛙和极火虾等）的序列比对分析，设计并优化了MIRA引物和探针。随后通过优化反应温度和试纸条显色时间对检测条件进行了精细化调整。结果表明，以水生eDNA为模板，优化的MIRA体系在37°C下孵育30分钟，再经20分钟LFD显色，即可获得清晰可判读的结果。该检测方法的DNA检出限为5.1 × 10?4 ng/μL，灵敏度高于常规聚合酶链式反应（PCR）。完整的MIRA-LFD流程可在50分钟内完成，其鉴定结果与高通量测序结果一致。该方法能够实现水生环境中镇海棘螈的特异性、高效且快速检测，为该物种的栖息地调查提供了实用的技术工具，在提高效率的同时降低了人力和资源需求，并为其他稀有动物的栖息地研究提供了潜在参考。
研究背景与科学问题
镇海棘螈（Echinotriton chinhaiensis）是中国特有的极危（Critically Endangered）两栖动物，被列为国家一级保护动物，野生种群数量极少，可能仅剩约300个体。该物种主要分布于浙江省宁波市北仑区的低山丘陵地带，繁殖期依赖特定的落叶覆盖微生境和半永久性静水水坑。传统的野外调查方法主要依赖晴天午后直接观察，不仅耗时费力，还易受气候、植被类型等多种环境因素影响，导致调查难度极大且近年野外目击记录稀少。此外，非法捕捉与贸易也对该物种构成持续威胁。因此，亟需建立一种简便、高效的调查与物种鉴定方法，以满足镇海棘螈野外调查、疑似残骸鉴定以及打击非法贸易的需求。
环境DNA（eDNA）分析技术在生态研究和物种调查中展现出显著优势，而多酶恒温快速扩增（MIRA）作为一种具备现场适用性、快速扩增、高灵敏度和可视化结果的分子诊断平台，在与侧向流试纸条（LFD）技术整合后，已成功应用于肉类真伪鉴定、特定病原体检测等多个领域。基于上述保护需求和现有技术基础，本研究旨在建立一种准确、简便的镇海棘螈野外检测方法，以节省人力与时间成本。
主要关键技术方法
研究人员采用了以下核心技术：利用环境DNA（eDNA）分析从水样中获取遗传物质；采用多酶恒温快速扩增（MIRA）技术进行核酸等温扩增；结合侧向流试纸条（LFD）实现扩增产物的可视化快速检测。研究中设计了针对镇海棘螈线粒体CytB基因的特异性MIRA引物和探针，并通过引入锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）修饰增强探针特异性。此外，研究还使用了高通量测序（eDNA metabarcoding）和常规物种特异性PCR结合桑格测序作为验证方法。水样于2024年8月至9月采集自浙江宁波镇海棘螈保护区及周边约5 km2区域内的相似水体，共收集197份水样（含5份已知阳性对照水样）。
研究结果
3.1 DNA提取与物种鉴定
从镇海棘螈组织提取的基因组DNA浓度范围为50.2至178.2 ng/μL，纯度（A260/A280）介于1.8至2.0之间；水样eDNA浓度范围为2.0至375.9 ng/μL。使用16S-F/R引物对进行PCR扩增，所有样本均获得约500 bp的特异性条带，经桑格测序和BLAST比对确认与镇海棘螈参考序列（EU880315.1）的相似度大于98%。
3.2 基于高通量测序的水样eDNA物种鉴定
对5份阳性水样和5份对照水样的eDNA进行12S rRNA宏条形码扩增和高通量测序，所有样本均成功完成物种注释。结果显示，镇海棘螈出现在所有10份eDNA样本的丰度前十物种中，同时鉴定出其他共生物种，如金猫、白唇树蛙、红原鸡、野猪、家鼠、泽蛙、绵羊、牛、鲫鱼和樱桃虾等。
3.3 MIRA引物与探针筛选
两种MIRA引物组合（MIRA-F/R1和MIRA-F/R2）均能特异性扩增目标序列。经特异性测试，只有MIRA-P1探针与MIRA-F/R1引物组合能在LFD上产生清晰的阳性信号且无交叉反应，而MIRA-P2和MIRA-P3探针出现假阳性。因此选定MIRA-F/R1与MIRA-P1作为最佳检测系统。温度优化实验表明，37°C时信号最强且最特异；时间优化显示，在37°C下扩增20分钟即可获得有效扩增，显色时间以20至25分钟为最优。
3.4 MIRA-LFD特异性
特异性测试结果显示，设计的MIRA引物和探针组合能特异性识别镇海棘螈，对六种对照物种（鲫鱼、樱桃虾、牛蛙、牛、猪、绵羊）及空白对照均无交叉反应。电泳分析与LFD试纸条结果一致，且LFD的可视化判读更为清晰便捷。
3.5 MIRA-LFD灵敏度
通过梯度稀释试验确定，MIRA-LFD的检出限为5.1 × 10?4 ng/μL，优于MIRA等温扩增结合琼脂糖凝胶电泳（5.1 × 10?3 ng/μL）和常规PCR（5.1 × 10?2 ng/μL），灵敏度排序为：MIRA-LFD > MIRA等温扩增 > 常规PCR。
3.6 水样eDNA检测结果
对197份水样eDNA进行检测，常规PCR结合桑格测序检出51份阳性样本（阳性率25.89%），而MIRA-LFD检出84份阳性样本（阳性率42.64%）。McNemar检验显示两种方法的检出率存在显著差异（p < 0.05），证明MIRA-LFD具有更高的灵敏度。基于这些阳性位点，研究团队在2026年4月的实地调查中发现了40个产卵水坑。
讨论与结论
研究表明，将eDNA分析与MIRA-LFD技术相结合，为镇海棘螈建立了一种快速、简便的可视化检测方法。该方法在37°C恒温条件下10至20分钟内即可完成扩增，整个流程在50分钟内完成，检出限达5.1 × 10?4 ng/μL。与同类MIRA应用相比，本研究的反应温度和时间参数处于合理范围。该方法相较于传统PCR具有更高灵敏度，且无需昂贵仪器，适用于现场快速检测。虽然后续实地调查未在所有阳性水样中观察到镇海棘螈个体，但这可能与调查时间和采样频率有关。未来工作将结合eDNA监测与实地调查加强对阳性水坑的保护。研究结论指出，该方法实现了对镇海棘螈的高效监测，具有高特异性和较高灵敏度，显著提升了野外调查与监测的工作效率。
