酶促交联胶原基生物墨水的可打印窗口动力学建模及子宫内膜类器官3D生物打印模型构建

《Bioactive Materials》：Enzymatic cross-linking collagen-based bioink for 3D bioprinting of endometrial model with endometrial epithelial organoids

研究人员开发了一种用于高保真挤出式3D生物打印的酶促交联胶原基生物墨水（bioink）。该胶原基体系以胶原（collagen）为主要生物活性基质，引入透明质酸（hyaluronic acid, HA）与经谷氨酰胺转移酶（transglutaminase, TG）优化墨水性能；TG催化胶原中谷氨酰胺残基γ-羧酰胺基与赖氨酸残基ε-氨基间酰基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键实现共价交联。研究人员提出以两步连续一级动力学模型描述室温下墨水流变演化，用储能模量G′超过约30 Pa确定预交联时间tp，以损耗正切tanδ=0.3终止打印过程以确定打印时长td，从而预测可打印窗口并指导三维结构制造。该生物墨水具有优良生物相容性，可支持人原代子宫内膜来源上皮类器官（endometrial epithelial organoids, EEOs）与间质细胞（endometrial stromal cells, ESCs）共培养，EEOs培养11天后仍保持高活力与激素响应功能。与Matrigel浇筑模型相比，3D生物打印体外子宫内膜模型表现出增强的激素响应性、长期存活能力及更贴近天然内膜的结构相似性，可作为Matrigel的潜在替代物用于子宫内膜生理与病理、胚胎-内膜互作等体外研究。

研究背景方面，人子宫内子宫内膜会随激素变化发生周期性重塑，感染、手术及子宫内膜异位症（endometriosis）、Asherman综合征等会导致内膜再生障碍并引起不孕。现有研究受伦理限制且动物模型转化相关性有限，因此构建可复现天然内膜结构与功能的体外三维人子宫内膜样组织具有重要意义。传统使用的Matrigel为肿瘤来源材料，存在成分不明确、机械强度低、可加工性差等问题，难以满足复杂内膜结构重建与临床转化需求。胶原作为细胞外基质主要成分，具生物活性、可被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）降解并含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid, RGD）序列，但低浓度细胞负载胶原墨水缺乏自支撑性，高浓度胶原水凝胶（hydrogel）纤维短密、孔隙与溶胀比低并导致细胞死亡；光固化或京尼平、单宁酸等化学交联又常带来细胞毒性或损害细胞铺展与功能。为此，研究人员开展酶促交联胶原基生物墨水及挤出式3D生物打印子宫内膜模型研究，论文发表于《Bioactive Materials》。该研究结论是：TG交联胶原基墨水可在温和条件下兼顾可打印性与生物活性，支持EEOs与ESCs共培养并维持长期活力与激素响应，较Matrigel模型在结构与功能上更接近天然子宫内膜，为内膜相关研究提供新平台。

主要关键技术方法上，研究人员将胶原海绵转化为pH 7.2–7.4的胶原悬液并经37 °C搅拌处理，以圆二色性（circular dichroism, CD）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估三股螺旋与链完整性；采用流变学表征温度依赖模量，利用TG在22 °C预交联调控墨水流变；建立B→D→P两步连续一级反应动力学模型拟合G′与tanδ随时间变化，以G′>约30 Pa和tanδ=0.3界定t_p与t_d可打印窗口；使用人原代子宫内膜来源EEOs与ESCs进行细胞负载打印及共培养，并以压缩模量、平衡溶胀、FITC-葡聚糖扩散、体外/体内降解等评价水凝胶物理性能。

研究结果部分，2.1 胶原悬液的性质（Properties of collagen suspension）：研究人员通过CD、DLS（动态光散射, dynamic light scattering）与SDS-PAGE证明37 °C搅拌最长12 h未造成可检测的三股螺旋结构或链完整性改变，但表观粒径随搅拌时间下降；流变显示27 °C到4 °C下G′与G″升高、tanδ降低，长时搅拌组模量更低而tanδ更高，故选用8 h搅拌条件。

2.2 水凝胶的物理性质（Physical properties of hydrogels）：研究人员依据TG催化谷氨酰胺γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-氨基形成ε-(γ-glutamyl)lysine异肽键的机制制备水凝胶；37 °C下C5H0T1压缩模量最高（3.55±0.44 kPa），C5H2T1为1.05±0.21 kPa且与Matrigel（0.72±0.16 kPa）无显著差异；C5H2T1溶胀比16.74±1.70，FITC-dextran穿透深度为C5H2T1＞C5H2T2＞C5H0T1；体外降解24 h各组质量渐降，体内第3、8、13天C5H2T1残留约80%、45%、20%。

2.3 胶原基墨水的可打印性（Printability of collagen-based bioink）：研究人员发现无TG配方在37 °C回转为液态，TG交联墨水在22 °C形成可挤出凝胶；打印流程为37 °C液态备墨、装针、22 °C预交联t_p、22 °C打印t_d、22 °C再稳定1 h。以G′超约30 Pa判t_p、tanδ=0.3止t_d，两步连续一级动力学模型拟合优度R²大于0.9，可定量预测可打印时间并获复杂打印结构。

2.3.1 交联动力学对墨水储能模量的影响（Effects of crosslinking kinetics on storage moduli of bioinks）：研究人员以B初始墨水、D第一步产物、P最终产物及速率常数k₁、k₂建立连续反应方程，用其解析墨水室温流变演化，从而为生物打印预交联与终止时间提供数学依据。

讨论与结论部分，研究人员指出Matrigel因来源与性质限制难支撑精准空间构建，而胶原虽生物活性高但打印性与稳定性难兼得；本研究以TG室温预交联在保持高细胞活力的同时优化流变，使胶原墨水具备自支撑与长期培养能力。研究结论为：酶促交联胶原基生物墨水可高保真挤出打印，支持人原代EEOs与ESCs共培养，打印子宫内膜模型较Matrigel模型具有更好生物功能与结构相似性，是Matrigel的潜在替代材料，可用于子宫内膜生理病理学、胚胎-子宫内膜相互作用及相关体外应用研究。