《Biotechnology Advances》：Advances in directed evolution: Mutagenesis, sensing, screening, and
in silico innovation
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摘要定向进化（Directed Evolution, DE）代表了一种关键的跨学科范式，协同整合了生物技术、计算方法和精密分析仪器。它能够在体外实验室环境中加速、可控地进化各类生物分子，使其趋向预定义的功能目标。本综述全面总结了核心定向进化框架的基本原理和前沿进展，涵盖诱变工
摘要
定向进化（Directed Evolution, DE）代表了一种关键的跨学科范式，协同整合了生物技术、计算方法和精密分析仪器。它能够在体外实验室环境中加速、可控地进化各类生物分子，使其趋向预定义的功能目标。本综述全面总结了核心定向进化框架的基本原理和前沿进展，涵盖诱变工程、生物传感、高通量筛选（HTS）、无细胞系统、展示技术以及整合计算策略。我们系统阐述了它们的内在特征、比较优势、固有瓶颈、适用范围以及未来的优化方向。此外，我们强调了这些技术在开发具有定制化功能特性的有机体、酶、抗体和各类功能生物分子方面的变革能力，其应用涵盖工业、临床和基础研究领域。总体而言，本工作旨在为当代定向进化平台提供一个全面的机制框架，并为未来的研究激发新的概念和方法学方向。
引言
自然进化通过地质时间尺度上的随机诱变和选择进行，产生表型多样性，使生物能够适应环境。定向进化（DE）在受控的实验室环境中模拟这种进化逻辑，将数百万年的自然分化压缩为实验上可操作的循环。与依赖先前结构和功能知识的理性设计方法不同，DE采用基于经验、表型驱动的策略。它向目标序列引入遗传变异，并对组合库进行严格设计的筛选或选择，从而富集具有所需功能特性的生物分子变体（Davis et al., 2017; Listov et al., 2024; Molina et al., 2022; Packer and Liu, 2015; Sarai et al., 2024; Yu et al., 2022）。
在过去几十年中，DE已成为生物技术、育种、合成生物学和生物分子工程中不可或缺且具有范式变革意义的工具。通过将进化原理与工程理性相结合，它使研究人员能够在人工环境中利用和加速改良表型的发展（Davis et al., 2017; Molina et al., 2022; Yu et al., 2022）。DE在现代生物技术中的核心地位源于四大基本优势。第一，它通过直接选择表型结果来规避不完全生物学认知的局限，绕过理论设计的不确定性（Davis et al., 2017; Declerck et al., 2026; Molina et al., 2022; Packer and Liu, 2015; Sarai et al., 2024; Yu et al., 2022）。这尤其相关，因为即使是同义突变也可能通过改变基因表达效率和共翻译折叠来影响蛋白质功能，这说明了基于序列预测的局限性（Niu et al., 2026; Shen et al., 2022）。DE通过大规模变体生成和选择来克服这一挑战。在某些情况下，DE可以完全改变原始基因功能，产生无法从现有数据推断的新表型（Turner, 2009）。第二，它能够定制生物分子以满足药物、生物燃料和工业生物催化中对性能的严格要求（Packer and Liu, 2015; Turner, 2009）。第三，它增强了有机体的稳健性，并为底盘菌株赋予定制化的代谢能力（Zeng et al., 2020）。最后，它深化了对进化动态的机制理解，推进了功能进化景观的探索（Zahradník et al., 2021）。总体而言，DE使具有前所未有的功能的生物分子成为可能，推动研究和产业创新。
一次定向进化行动通过三个紧密相连的模块运行：诱变、传感和筛选（图1）。诱变模块生成遗传多样化的库，定义进化的搜索空间（Molina et al., 2022）。这些技术通过体外或体内方式向感兴趣基因（GOI）引入随机或特异性突变，从而最大化多样性以供后续选择。传感模块将分子表型转化为可量化的物理信号（例如，吸光度、荧光、生长速率等），使所需的性状能够被检测和量化（Hwang et al., 2023）。筛选模块随后从这些库中分离出高性能变体，方法从手动选择到自动化高通量筛选（HTS）不等（Thomas et al., 2025; Zeng et al., 2020）。筛选方法的效率和特异性对于DE的成功至关重要。这种迭代过程涉及多轮选择和再诱变，以逐步精炼突变体并鉴定最优变体，使DE成为现代生物技术中的有力工具（Crook et al., 2016; Molina et al., 2022; Turner, 2009; Zeng et al., 2020）。
本综述系统总结了DE近期的技术突破、机制原理和转化应用，旨在明确当前前沿并指导未来创新。
各节摘要
诱变生成
DE的功能实现依赖于诱变生成、信号感知和高通量筛选的有序协调。每个技术层级在逻辑上构建于前一层级之上，从遗传多样化推进到表型筛选。诱变生成决定了序列探索的范围，库的多样性直接决定了鉴定有益变体的可能性。当代DE采用了一套全面的诱变工具箱，涵盖体外随机诱变、
体内生物传感调控
为了建立稳健的基因型-表型联系，DE整合了在DNA、RNA和蛋白质水平上运行的多层次生物传感调控回路，这些回路赋予不同的信号控制和信号放大模式。在DNA水平，调控机制包括功能基因拯救、由启动子和转录因子介导的转录精细调控，以及通过质粒或病毒复制动力学实现的基因剂量调节（图5A）。失活的生物传感
无细胞定向进化系统
无细胞合成平台已成为定向进化中快速生物分子筛选和功能评估的关键工具（Landwehr et al., 2025; Lazar et al., 2026; Xu et al., 2025a）。这些由定义明确的纯化生化组分构建的体外系统能够实现感兴趣基因（GOI）的自主表达，同时绕过复杂的胞内微环境。因此，突变体的功能特性可以直接量化，而无需细胞转化或体内异源
与定向进化相关的展示技术
分子展示技术已经革新了定向进化中的蛋白质和肽工程（Jaroszewicz et al., 2022; Rojo-Gallegos et al., 2026; Vázquez-Rivera et al., 2026）。噬菌体展示通过将肽或蛋白质库与噬菌体衣壳蛋白融合来运作，是最成熟的展示技术。所展示的蛋白质与其包装在噬菌体颗粒内的编码DNA物理连接，使选定的结合物能够直接回收和扩增。噬菌体展示
计算导向的定向进化（In silico-DE）
定向进化的一个基本瓶颈是庞大的突变序列空间，远远超过了穷尽表型筛选的能力。例如，一个中等大小的400个氨基酸的蛋白质具有20400种理论变体，这个量级远远超出了所有现有筛选能力的范围（Gantz et al., 2023; Lim et al., 2025; Markel et al., 2020; Nielsen et al., 2023; Seo et al., 2025; Xu et al., 2025a）。鉴于对如此庞大的酶序列
酶工程
DE已被广泛用于工程化理想的酶特性，涵盖催化活性、底物包容性和结构稳定性（图7）。在基本催化机制和过渡态稳定化理论的指导下，DE通过蛋白质支架重塑介导新颖催化功能的从头生成，从而扩展了生物催化系统的催化文库（Hwang et al., 2023; Li et al., 2023; Listov et al., 2024; Liu et al., 2026b;
诱变和筛选的局限性
传统的体内随机诱变策略存在固有的局限性，包括次优且不可控的突变率（MR）、偏倚的突变景观以及非预期的脱靶扰动。这些缺陷加剧了细胞毒性，降低了转化效率，并导致有益功能变体的耗竭。尽管现代靶标定向随机诱变系统有了显著改善，但大规模探究基因型-表型关系
结论
总之，DE作为现代生物工程中的范式转变，赋能了生物分子的理性优化，适用于广泛的生物技术应用。尽管当前技术实施中仍存在持续瓶颈，但日益增长的关注于开发高效且可扩展的定向进化框架，凸显了其不可或缺的重要性。这些新兴技术协同整合了精准基因编辑等核心支撑技术
生成式人工智能和AI辅助技术在写作过程中的声明
在本工作准备过程中，作者使用了ChatGPT来提高文本的可读性和质量。在使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。
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