阿卡波糖差异性影响肠道微生物对麦芽糖和蔗糖的代谢，显著调节宿主代谢

《iScience》：Acarbose differentially affects gut microbial metabolism of maltose and sucrose, distinctly modulating host metabolism

　　

重点摘要•阿卡波糖通过细菌转运蛋白进入体内以抑制麦芽糖代谢•使用阿卡波糖时，蔗糖（而非麦芽糖）可增加短链脂肪酸并调节肠促胰素•在高脂饮食+蔗糖条件下，阿卡波糖增加参与短链脂肪酸产生的微生物群•阿卡波糖与蔗糖联用时比与麦芽糖联用时更有效地预防肥胖摘要肠道微生物群作为宿主的有益共生体发挥重要作用。给予α-葡萄糖苷酶抑制剂（α-GIs）被认为可增加微生物群的碳水化合物可用性，从而调节短链脂肪酸（SCFA）的产生。然而，宿主与微生物群的相互作用是否因α-GI类型（如阿卡波糖与米格列醇）以及共同给予的碳水化合物类型不同而存在差异，目前仍不清楚。在本研究中，我们证明阿卡波糖通过细菌外膜孔蛋白LamB和ScrY被转运，并抑制大肠杆菌中的麦芽糖代谢。此外，利用肺炎克雷伯菌的研究表明，阿卡波糖抑制麦芽糖的利用，但不抑制蔗糖的利用。当在小鼠中与阿卡波糖共同给予时，与麦芽糖相比，蔗糖增强了短链脂肪酸的产生，抑制了葡萄糖依赖性促胰岛素肽（GIP）的分泌，并保护机体免受高脂饮食诱导的肥胖，强调了蔗糖作为微生物群依赖的有益因素而非宿主代谢的罪魁祸首的重要性。总之，阿卡波糖部分通过以碳水化合物类型依赖的方式调节肠道微生物代谢来调控宿主代谢过程。图解摘要引言包括人类和小鼠在内的哺乳动物在肠腔内栖息着大约10^14个微生物，该环境具有稳定的温度、厌氧条件和丰富的营养物质。肠道微生物群的存活和增殖主要依赖于宿主饮食来源的营养物质。反过来，宿主从肠道微生物群中获益于多个方面，从而使其成为必不可少的代谢伙伴而非被动居民。维持正常肠道微生物群的重要性得到了大量研究的强调，这些研究将微生物组成的改变（称为菌群失调）与各种疾病联系起来。菌群失调可由多种因素引起，包括口服抗生素的使用和西方风格的高脂饮食。前者可引起由艰难梭菌扩增介导的假膜性结肠炎，而后者则与代谢障碍相关，包括肥胖和2型糖尿病。在微生物群产生的因子中，来源于碳水化合物发酵的短链脂肪酸（SCFAs）是关键的信号分子。SCFAs通过调节肠促胰素激素（包括胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素肽（GIP））的分泌来抑制肥胖并调节肠内分泌信号。这些肠促胰素增强胰腺β细胞分泌胰岛素并有助于能量稳态。值得注意的是，据报道SCFAs增加GLP-1分泌但减少GIP分泌，表明它们对肠促胰素反应进行协调但不同的调控。哺乳动物摄入的膳食碳水化合物大部分以多糖的形式存在，在进入小肠后被α-葡萄糖苷酶水解为单糖后才被吸收。利用这一特性，α-葡萄糖苷酶抑制剂（α-GIs）被开发用于减轻餐后高血糖。在α-GIs存在的情况下，未被消化的多糖留在肠腔内，充当微生物群可及碳水化合物（MACs）。我们此前报道，α-GI米格列醇与麦芽糖共同给予可增强微生物群来源的SCFA产生，伴随GLP-1分泌增加和GIP分泌受抑。由于这些反应在无细菌小鼠中完全消失，微生物群来源的因子（包括SCFAs）似乎是应对MAC可用性增加时肠促胰素分泌的关键介导因子。然而，存在一个引人注目的差异：阿卡波糖尽管属于同一药物类别，但对肠促胰素分泌的影响显著弱于米格列醇。这两种药物差异化影响微生物群介导的麦芽糖代谢的机制仍不清楚。在此，我们使用互补的体内和体外方法证明，阿卡波糖（而非米格列醇）通过选择性抑制细菌麦芽糖利用而不影响蔗糖代谢来调节肠道微生物碳水化合物代谢。因此，单次顿服将蔗糖与阿卡波糖共同给予小鼠，可增强SCFA产生并显著调节肠促胰素分泌。在高脂饮食条件下，慢性阿卡波糖补充联合高蔗糖（而非高麦芽糖）饮食可保护机体免受饮食诱导的肥胖（DIO），同时血浆丙酸盐和丁酸盐浓度升高，GIP分泌受抑。总之，这些发现揭示，蔗糖——一种传统上被视为代谢风险因素的膳食成分——当与阿卡波糖共同给予时，可作为抗肥胖益生元发挥保护作用。结果米格列醇（而非阿卡波糖）增强小鼠麦芽糖来源的SCFA产生为确定不同的α-GIs是否差异化影响餐后SCFA产生，我们让小鼠接受口服麦芽糖挑战，联合或不联合给予米格列醇或阿卡波糖（图1A）。基于初步的口服麦芽糖耐受试验，选择了10 mg/kg米格列醇和40 mg/kg阿卡波糖的剂量，因为它们产生了相当的餐后血糖反应抑制效果（图S1A）。尽管米格列醇和阿卡波糖与单独麦芽糖相比显著减弱了餐后血糖升高（图1B），但它们对SCFA产生的作用存在显著差异。当与麦芽糖共同给予时，米格列醇显著增加了门静脉血浆中除异丁酸盐外所有SCFAs的浓度，但阿卡波糖没有这种作用（图1C）。这些结果表明，尽管在α-GI共同给予后肠腔内麦芽糖可用性可能增加，但阿卡波糖（而非米格列醇）可能限制了微生物的麦芽糖利用。图1 米格列醇（而非阿卡波糖）增强小鼠麦芽糖来源的SCFA产生显示完整图注图查看器（A）体内SCFA产生测量的示意图。（B和C）单独口服麦芽糖、麦芽糖+米格列醇或麦芽糖+阿卡波糖后30分钟时的血糖水平（B）和门静脉血浆SCFA浓度（C）（n = 4-8个生物学重复）。溶剂处理的小鼠作为对照。在（B）中，溶剂和麦芽糖+米格列醇组的数据引自Ma等人（2022）。这些组与本研究中新呈现的数据来自同一实验。数据以均值±标准误表示。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001，通过单因素方差分析后Tukey多重比较检验确定。另见图S1。阿卡波糖通过麦芽糖孔蛋白LamB进入抑制大肠杆菌麦芽糖代谢为在体外比较阿卡波糖和米格列醇对细菌麦芽糖代谢的影响，我们使用大肠杆菌作为遗传可操纵的概念验证模型，其具有成熟的麦芽糖转运和代谢系统（表1）。当在含麦芽糖作为唯一碳源的M9最小培养基（M9/麦芽糖）中培养时，大肠杆菌生长并释放乙酸（图2A）。添加米格列醇不影响细菌生长或乙酸产生，而阿卡波糖则显著抑制了两者（图2A）。然而，当培养基中的碳源从麦芽糖改为葡萄糖时，阿卡波糖未能抑制细菌生长；相反，在M9/葡萄糖培养基的后期阶段促进了生长（图2B）。相比之下，添加米格列醇不影响细菌生长（图2B）。为明确阿卡波糖的生长抑制作用是否需要其进入细菌内部，我们构建了缺乏外膜麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌ΔlamB菌株。在野生型大肠杆菌中，LamB蛋白表达在M9/麦芽糖培养基中高于M9/葡萄糖培养基（图2C），这与LamB表达受麦芽糖操纵子调控的观点一致。在ΔlamB菌株中，LamB表达缺失，而其通过质粒构成性遗传拯救（ΔlamB/lamBEc）恢复了表达，达到与野生型大肠杆菌在M9/麦芽糖培养基中相当的水平（图2C）。在ΔlamB菌株中，阿卡波糖的生长抑制作用减弱（图2D），而其遗传拯救恢复了阿卡波糖诱导的生长抑制（图2E），表明LamB介导的阿卡波糖摄入抑制了其在麦芽糖上的生长。如前所述，LamB表达在M9/葡萄糖培养基中受抑（图2C）。因此，阿卡波糖在M9/葡萄糖中培养的野生型大肠杆菌中没有生长抑制作用（图1B）可能归因于LamB表达减少。为排除这种可能性，我们检测了在M9/葡萄糖培养基中也能构成性表达LamB的ΔlamB/lamBEc菌株的细菌生长（图2C）。ΔlamB/lamBEc菌株在M9/葡萄糖培养基中的生长未被阿卡波糖抑制（M9/葡萄糖+阿卡波糖）（图2F），表明细胞内阿卡波糖的存在不影响细菌在葡萄糖上的生长。鉴于阿卡波糖与麦芽四糖的结构相似性（图2G），推测阿卡波糖通过内膜ABC转运蛋白MalEFGK2（由malE、malF、malG和malK组成）被转运入胞质（图2H）。这些基因由转录因子MalT反式激活，当MalEFGK2在底物转运过程中发生形态变化时，MalEFGK2-MalT复合物分离（图2H）。因此，我们通过监测向M9培养基中添加阿卡波糖后malE、malF和malK的反式激活来评估阿卡波糖向大肠杆菌胞质中的转运。定量RT-PCR分析显示，阿卡波糖单独以剂量依赖方式增加malE、malF和malK的表达（图2I），表明阿卡波糖模拟麦芽四糖并激活麦芽糖调控子。为确定生长抑制是由阿卡波糖的瓦伦胺基团（贡献其α-葡萄糖苷酶抑制活性，图S2A）引起，还是由其与细菌麦芽糖利用系统的竞争引起，我们检测了另一种α-GI沃格列波糖（图S2B，含瓦利胺基团，图S2C）和麦芽四糖（结构和大分子量与阿卡波糖相似但缺乏α-GI活性）对大肠杆菌生长的影响。沃格列波糖和麦芽四糖在2 mM浓度下均未抑制大肠杆菌在M9/麦芽糖培养基中的生长（图S2D和S2E）。通过代谢组学分析评估了阿卡波糖对大肠杆菌麦芽糖代谢的影响。当向M9培养基中加入麦芽糖时，丙酮酸及其下游糖酵解代谢物（乙酰辅酶A、琥珀酸和乳酸）增加，而上游代谢物（磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸甘油酸）减少，表明麦芽糖代谢上调（图2J）。相比之下，在M9/麦芽糖培养基中进一步添加阿卡波糖导致未消化的阿卡波糖和麦芽糖在细胞内积累，而阿卡波糖显著减少了丙酮酸和其他糖酵解下游代谢物（图2J）。图2 阿卡波糖通过麦芽糖孔蛋白LamB进入抑制大肠杆菌麦芽糖代谢显示完整图注图查看器（A和B）大肠杆菌的细菌生长曲线（A和B）以及释放到培养基中的乙酸（A）（n = 4个生物学重复）。（C）三种大肠杆菌菌株在培养6小时后收获的LamB和RNA聚合酶β亚基（RpoB）的免疫印迹分析（n = 1个生物学样本，独立实验）。（D-F）基因改造大肠杆菌菌株的细菌生长曲线（n = 4个生物学重复）。（G）麦芽四糖（PubChem 123966）和阿卡波糖（PubChem 9811704）的结构比较。（H）大肠杆菌麦芽糖寡糖转运和mal操纵子激活的示意图。（I）大肠杆菌malE、malF和malK的RT-qPCR分析（n = 5个生物学重复）。（J）在补充麦芽糖的M9培养基中处理的大肠杆菌W3110的细胞内代谢物谱（每组n = 3个独立生物学样本）。数据以均值±标准误表示。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001，通过单因素方差分析后Tukey多重比较检验确定。另见图S2。表1 本研究使用的细菌菌株| 菌株 | 描述 | 来源 ||------|------|------|| 大肠杆菌 DH5α | F-, Φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK-, mK+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1 | 本实验室收藏 || 大肠杆菌 W3110 | F-, λ-, rphI | 本实验室收藏 || 肺炎克雷伯菌 Kpc01 | 血流临床分离株 | Yamanaka等人 || 大肠杆菌 W3110 ΔlamB | 大肠杆菌W3110中ΔlamB::FRT | 本研究 || 大肠杆菌 W3110 ΔlamB/pscrY | 大肠杆菌W3110携带pscrY | 本研究 || 大肠杆菌 W3110 ΔlamB/plamBEc | 大肠杆菌W3110携带plamBEc | 本研究 || 大肠杆菌 W3110 ΔlamB/plamBKp | 大肠杆菌W3110携带plamBKp | 本研究 |计算模拟预测阿卡波糖与细菌酶MalQ和MalP相互作用在大肠杆菌中，麦芽糖代谢主要由α-淀粉麦芽糖酶MalQ和麦芽寡糖磷酸化酶MalP介导，两者协同驱动胞质糖酵解。胞质中的麦芽糖被MalQ转化为具有不同聚合度的麦芽寡糖，而MalP催化麦芽寡糖非还原端的磷酸解，据报道麦芽五糖是最短底物，从而释放1-磷酸葡萄糖。鉴于已知阿卡波糖样分子可结合MalQ的催化位点，阿卡波糖补充后未消化麦芽糖在细胞内积累的观察结果（图2J）支持了MalQ活性在体内大肠杆菌中受到功能性抑制的推测。为评估这一可能性，我们使用MalQ的底物结合构象进行了分子对接模拟。催化位点（Asp448、Glu496和Asp548）的结合亲和力随聚合度增加而增强（麦芽糖 < 麦芽三糖 < 麦芽四糖），而阿卡波糖表现出与麦芽三糖相当的亲和力（图3A）。与此趋势一致，对接分析预测麦芽糖仅与Asp548（假定的过渡态稳定器；2.1 ?）形成氢键，而阿卡波糖额外与Glu496（酸/碱催化剂；2.6 ?）相互作用。

相比之下，预测麦芽四糖与所有三个催化残基相互作用，包括亲核侧链 Asp448（图 3A）。为了评估这些相互作用中的差异性亲和力是否反映在细菌生长中，在含有麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖或麦芽六糖，有无阿卡波糖的 M9 最小培养基中培养大肠杆菌。阿卡波糖在整个观察期（48 小时）内完全抑制了大肠杆菌在麦芽糖上的生长，而在含有麦芽三糖、麦芽四糖或麦芽六糖的 M9 培养基中，生长在 24 小时后恢复（图 3B），表明阿卡波糖的抑制作用取决于 α-1,4-葡聚糖链的长度。我们还进行了针对胞质麦芽糊精磷酸化酶 MalP 的对接模拟。预测阿卡波糖比低聚麦芽糖更favorably结合于催化位点，采取更接近芳香族残基的姿势，包括 Tyr280（+2 亚位点）和 Tyr613（+4 亚位点）（图 3C）。一致地，代谢组分析显示，当细胞用阿卡波糖处理时（M9/麦芽糖 + 阿卡波糖），细胞内积累了更长的麦芽糊精，包括麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖，表明阿卡波糖损害了 MalP 介导的麦芽糊精磷酸解（图 3D）。尽管外源补充更长的低聚麦芽糖即使在存在阿卡波糖的情况下也支持细菌生长（图 3B），但这些底物的细胞内积累未能恢复糖酵解过程（图 2J 和 3D），表明麦芽糖不能被 MalQ 有效地转化为更长的低聚麦芽糖，从而限制了随后由 MalP 进行的磷酸解。综上所述，这些发现表明大肠杆菌中的 LamB 介导阿卡波糖的摄取，随后由 MalEFGK2 运输进入细胞质，在此阿卡波糖可能干扰 MalQ 和 MalP 介导的胞质麦芽糊精代谢，导致糖酵解通量受抑和生长受损。图 3 计算模拟预测阿卡波糖与细菌酶 MalQ 和 MalP 相互作用显示完整图注图像查看器(A) 使用 AutoDock Vina 进行的对接模拟预测了低聚麦芽糖和阿卡波糖在 MalQ 催化口袋内的结合（大肠杆菌 MalQ 与阿卡波糖苷 - 葡萄糖 - 阿卡波糖（AGA）复合物；PDB 4S3R），估计结合能（kcal mol?1）（麦芽糖 ?7.74 ± 0.05；麦芽三糖 ?8.40 ± 0.09；麦芽四糖 ?8.61 ± 0.62；阿卡波糖 ?8.32 ± 0.03；n = 5 次独立对接模拟）。(B) 在大肠杆菌在含有或不含阿卡波糖的 M9/麦芽糖、M9/麦芽三糖、M9/麦芽四糖和 M9/麦芽六糖中的生长曲线（n = 3 个生物学重复）。(C) 对接模拟预测了低聚麦芽糖和阿卡波糖在 MalP 催化口袋内的结合（大肠杆菌 MalP 与阿卡波糖复合物；PDB 2ECP），估计结合能（kcal mol?1）（麦芽糖 ?6.76 ± 0.01；麦芽三糖 ?7.23 ± 0.26；麦芽四糖 ?7.79 ± 0.30；阿卡波糖 ?7.97 ± 0.06；n = 5 次独立对接模拟）。(D) 与图 2J 相同条件下的细胞内低聚麦芽糖水平（n = 3 个生物学重复）。颜色表示用于对接的配体：浅蓝色，麦芽糖；蓝色，麦芽三糖；深蓝色，麦芽四糖；粉色，阿卡波糖。A 和 C 中的数据以平均值 ± 标准差表示，B 和 D 中的数据以平均值 ± 标准误表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，通过单因素方差分析后接 Tukey 多重比较检验确定。阿卡波糖由蔗糖外孔蛋白 ScrY 运输，并抑制肺炎克雷伯菌在麦芽糖上而非蔗糖上的生长LamB 属于碳水化合物特异性外孔蛋白家族。该家族还包括 ScrY，即在参与肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）蔗糖代谢的质粒 pUR400 中鉴定的偏好蔗糖的成员。尽管 ScrY 与 LamB 在结构和功能上高度相似，，但尚不清楚 ScrY 是否识别并运输阿卡波糖。我们通过测试在缺乏 LamB 的大肠杆菌（ΔlamB/scrY）中遗传转导 ScrY 是否恢复阿卡波糖的生长抑制作用来评估这一点。在 ΔlamB/scrY 菌株中，阿卡波糖对麦芽糖上的生长抑制作用与野生型大肠杆菌 W3110 中观察到的相似（图 4A），表明 ScrY 像 LamB 一样运输阿卡波糖。此外，将肺炎克雷伯菌的 LamB 转导到大肠杆菌 ΔlamB 菌株中（ΔlamB/lamBKp），在麦芽糖上生长时也恢复了阿卡波糖的生长抑制作用（图 4B）。鉴于阿卡波糖由肺炎克雷伯菌的 ScrY 和 LamB 运输，我们接下来检查了阿卡波糖是否抑制以麦芽糖和蔗糖为碳源生长的肺炎克雷伯菌的生长。据报道，，肺炎克雷伯菌在 M9/麦芽糖和 M9/蔗糖培养基中均能生长。阿卡波糖对麦芽糖上肺炎克雷伯菌生长的抑制作用并非通过完全阻止生长，而是通过延迟生长。相比之下，在蔗糖上生长时，阿卡波糖未能抑制其生长，反而增强了生长（图 4C）。与其生长模式一致，阿卡波糖延迟了肺炎克雷伯菌在麦芽糖上培养时的乙酸盐积累，在 4 小时时消除乙酸盐产生，而在 8 和 10 小时时乙酸盐水平升高（图 4D）。相比之下，阿卡波糖在蔗糖上培养时对乙酸盐积累没有实质影响（图 4D）。总之，这些体外分析表明，阿卡波糖对细菌代谢的影响不同，取决于细菌物种和可利用的碳水化合物类型。图 4 阿卡波糖由蔗糖外孔蛋白 ScrY 运输，并在小鼠中与蔗糖共同给药时降低 GIP 同时增加 GLP-1显示完整图注图像查看器(A 和 B) 用肺炎克雷伯菌来源的 ScrY（ΔlamB/scrY）(A) 和 LamB（ΔlamB/lamBKp）(B) 互补的大肠杆菌 ΔlamB 菌株的细菌生长曲线（n = 4 个生物学重复）。(C) 在含有或不含阿卡波糖的 M9/麦芽糖或 M9/蔗糖中培养的肺炎克雷伯菌的生长曲线（n = 3 个生物学重复）。(D) 在 (C) 所示条件下肺炎克雷伯菌培养基中的乙酸盐浓度（n = 5 个生物学重复）。带有 Welch 校正的非配对 t 检验的 p 值：*p < 0.05。(E–G) 口服共同给药阿卡波糖与麦芽糖（麦芽糖 + 阿卡波糖）或蔗糖（蔗糖 + 阿卡波糖）后 30 分钟的门静脉 SCFA（E）、GIP（F）和 GLP-1（G）水平（n = 7–12 个生物学重复）。数据以平均值 ± 标准误表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，通过单因素方差分析后接 Tukey 多重比较检验确定。当阿卡波糖在小鼠中与蔗糖共同给药时，蔗糖比麦芽糖更强烈地增加门静脉 SCFAs，降低 GIP 并增加 GLP-1如上所示，阿卡波糖抑制了肺炎克雷伯菌在麦芽糖上的生长和乙酸盐产生，但在蔗糖上则不然。由于肺炎克雷伯菌不是典型的共生菌，而是人体肠道中的机会致病菌，仅在此菌株中观察到的对阿卡波糖的反应可能无法反映参与蔗糖代谢的肠道共生菌的反应。因此，我们接下来评估了阿卡波糖与麦芽糖或蔗糖共同给药后对健康小鼠血浆 SCFA 水平的影响。门静脉 SCFA 水平在共同给药蔗糖 + 阿卡波糖（蔗糖 + 阿卡波糖）后增加，但在共同给药麦芽糖 + 阿卡波糖（麦芽糖 + 阿卡波糖）后仅略有增加（图 4E），这与我们在大肠杆菌（图 2A）和肺炎克雷伯菌（图 4D）中的发现一致。蔗糖 + 阿卡波糖引起的门静脉 SCFA 水平增加大于麦芽糖 + 阿卡波糖，促使我们测量门静脉肠促胰素水平。根据我们之前的发现，当与阿卡波糖共同给药时，蔗糖更强烈地抑制 GIP 分泌（图 4F）并增强 GLP-1 分泌（图 4G）。综上所述，当与阿卡波糖共同给药时，蔗糖比麦芽糖更有效地诱导小鼠肠道微生物组产生 SCFA 并调节肠促胰素分泌。在高蔗糖喂食下，阿卡波糖比在高麦芽糖喂食下对饮食诱导的肥胖提供更强的保护我们确定了麦芽糖和蔗糖在与阿卡波糖共同给药时对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的细菌生长（图 2 和 4）以及小鼠血浆 SCFA 和肠促胰素水平（图 4E–4G）的不同影响。这些发现促使我们测试在阿卡波糖慢性饮食暴露期间，麦芽糖和蔗糖是否对肠道微生物组和宿主代谢产生不同的影响。由于微生物群产生的 SCFAs 对宿主具有多种有益作用，包括保护对抗肥胖，我们假设阿卡波糖可能通过与饮食二糖（麦芽糖或蔗糖）和肠道微生物群的相互作用影响饮食诱导的肥胖。由于阿卡波糖是一种抑制肠道碳水化合物消化的 α-糖苷酶抑制剂，我们首先在饲喂无二糖、低碳水化合物、高脂（HF）饮食（表 S2）的小鼠中评估了其抗肥胖效果。阿卡波糖在 6 周内轻微抑制了 HF 饮食诱导的体重增加（?4%；图 S3A）。一致地，阿卡波糖将附睾白色脂肪组织（eWAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）重量分别减少了 32% 和 38%（图 S3B），表明 α-糖苷酶抑制本身有助于在 HF 喂食条件下抑制脂肪积累。与 α-糖苷酶抑制对阿卡波糖抗肥胖作用的贡献一致，HF 饮食中补充葡萄糖/果糖（HF + glc/fru）消除了阿卡波糖对体重增加和脂肪组织积累的抑制作用（图 S3C 和 S3D）。我们接下来检查饮食中的麦芽糖是否进一步增强阿卡波糖的抗肥胖效果。与饲喂正常饲料（ND）的小鼠相比，6 周的高脂高麦芽糖（HF/HM）饮食饲喂使体重增加了 151%，而阿卡波糖补充将这种增加减少到 140%（图 5A）。这种体重减轻伴随着 eWAT（?19%）和 iWAT（?24%）重量的减少（图 5B）。在自由取食条件下，门静脉肠促胰素水平在 GIP 上倾向于下降（p = 0.3），但在 GLP-1 上显著增加（图 5C）。随后，我们使用高脂高蔗糖（HF/HS）饮食研究了蔗糖是否进一步增强阿卡波糖的抗肥胖效果。与饲喂 ND 的小鼠相比，HF/HS 喂食诱导体重增加 140%（图 5D），与饲喂 HF/HM 饮食的小鼠观察到的情况相当（图 5A）。然而，阿卡波糖对 HF/HS 诱导的肥胖的减弱程度（?33%）显著大于 HF/HM 饮食诱导的肥胖（?11%）；同时伴随着饮食诱导的 eWAT（?77%）和 iWAT（?75%）重量扩张的减少（图 5E）。此外，阿卡波糖对 GIP 水平降低和 GLP-1 水平升高的影响在 HF/HS 饮食喂食下比在 HF/HM 饮食下更为明显（图 5F）。通过分析粪便 16S rRNA 基因测序，研究了麦芽糖或蔗糖与阿卡波糖长期补充对肠道微生物组概况的影响。与饲喂 ND 的小鼠相比，长期饲喂 HF/HM 和 HF/HS 饮食在门水平上诱导了类似的肠道微生物组组成变化，其特征是厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加（图 5G），这与之前的报道一致。HF/HM 和 HF/HS（HF/HM + 阿卡波糖和 HF/HS + 阿卡波糖）饮食中阿卡波糖的补充恢复了这些变化（图 5G）。与这种组成转变一致，阿卡波糖处理的小鼠表现出降低的肠道微生物 α 多样性（图 5H）。然而，主坐标分析（PCoA）显示，阿卡波糖处理组形成的簇与其各自的对照组以及彼此不同，表明 HF/HM + 阿卡波糖和 HF/HS + 阿卡波糖在更精细的分类水平上存在组成差异（图 5I）。为了确定对 HF/HM + 阿卡波糖和 HF/HS + 阿卡波糖饮食之间组成差异有贡献的细菌分类群，我们进行了线性判别分析效应量（LEfSe）。该分析确定了 7 个在饲喂 HF/HS + 阿卡波糖的小鼠中显著富集的属，包括理研菌科 RC9、拟杆菌属、阿克曼菌属、梭菌属 UCG-014（Clodtridia）、寄生菌属、小鼠杆菌属和瘤胃球菌属。相比之下，8 个属在饲喂 HF/HM + 阿卡波糖的小鼠中显著富集，包括副拟杆菌属、毛螺旋菌科 NK4A136、GCA-900066575、黏螺旋菌属、乳球菌属、UGC-010、丁酸球菌科和 A2（LDA 得分 < 2）（图 5J）。为了进一步研究阿卡波糖诱导的微生物组改变的功能后果，我们进行了基于 PICRUSt2 的功能预测分析。我们比较了阿卡波糖处理组与未处理组之间分配给 KEGG 淀粉和蔗糖代谢途径（ko00500）的 EC 的相对丰度。在 HF/HS + 阿卡波糖中，与 HF/HS 相比，参与淀粉和蔗糖代谢的酶，包括水解（EC 3.2.1.20）和随后的磷酸化（EC 2.7.1.1），显著富集（图 5K）。相比之下，与 HF/HM 相比，HF/HM + 阿卡波糖未表现出与麦芽糖代谢相关的酶（EC 2.4.1.25、EC 2.4.1.8 和 EC 3.2.1.122）的一致富集（图 S3E），表明在慢性饮食条件下，阿卡波糖选择性增强淀粉和蔗糖的微生物代谢能力，而不是增强麦芽糖代谢。为了确定对预测的蔗糖代谢能力有贡献的细菌分类群，我们进一步进行了 PICRUSt2 贡献分析。在 LEfSe 分析中与 HF/HM + 阿卡波糖相比在 HF/HS + 阿卡波糖中显著富集的拟杆菌属（图 5J），占据了预测的 EC 3.2.1.20 和 EC 2.7.1.1 功能的很大一部分，表明拟杆菌属是阿卡波糖相关增强微生物淀粉和蔗糖代谢的候选贡献者（图 5L）。

基于这些发现，我们进一步定量分析了门静脉中的短链脂肪酸（SCFA）浓度，以确定肠道微生物代谢的这些变化能否在体内导致SCFA产生发生改变。在四种膳食条件下（HF/HM、HF/HS、HF及HF + 葡萄糖/果糖），阿卡波糖均显著提高了门静脉丙酸盐浓度，其中在HF/HS + 阿卡波糖组中增幅最大（图5M和图S3F）。此外，HF/HS + 阿卡波糖组的门静脉丁酸盐浓度也显著升高。值得注意的是，在HF + 阿卡波糖组和HF + 葡萄糖/果糖 + 阿卡波糖组中丙酸盐的增幅与HF/HM + 阿卡波糖组中观察到的增幅相似，而在后者中阿卡波糖的抗肥胖作用有限；但两者增幅均明显小于HF/HS + 阿卡波糖组中所观察到的增幅。肠道菌群形成丙酸盐的途径据报道包括三条代谢通路：琥珀酸途径、丙烯酸途径和1,2-丙二醇途径。因此，我们考察了与HF/HS + 阿卡波糖组中细菌属富集相关的潜在代谢通路。琥珀酸途径（P1）涉及拟杆菌属、副消化链球菌属、 Akkermansia菌属和Rikenellaceae RC9菌科，丙烯酸途径（P2）涉及梭菌属UCG-014和厌氧梭菌属，这两条通路在HF/HS + 阿卡波糖组相对于HF/HM + 阿卡波糖组所富集的属中代表了最大的预测贡献，提示它们参与了蔗糖来源底物向丙酸盐的转化（图S4）。为在种水平上鉴定细菌分类群并评估其在HF/HS + 阿卡波糖组中的富集情况，我们对通过16S rRNA测序获得的ASV序列进行了BLAST分析（表S1），随后通过特异性qPCR定量最匹配的近缘细菌物种。该分析显示，与HF/HM + 阿卡波糖组相比，HF/HS + 阿卡波糖组中显著富集了结肠拟杆菌、椭圆拟杆菌、萨氏拟杆菌、粪便副消化链球菌和粘蛋白嗜极菌，提示这些细菌物种可能参与了蔗糖来源底物向丙酸盐的转化。综上所述，这些发现表明阿卡波糖与蔗糖联用后增强的抗肥胖作用涉及肠道菌群—SCFA—肠促胰素轴。

图5 阿卡波糖在高蔗糖喂养条件下比在高麦芽糖喂养条件下对饮食诱导的肥胖提供更大的保护作用

(A–C) 阿卡波糖补充对饲喂HF/HM饮食小鼠体重（A）、白色脂肪组织质量（B）及门静脉GIP和GLP-1水平（C）的影响。正常饮食（ND）组小鼠作为参考（n = 8–10个生物学重复）。

(D–F) 阿卡波糖补充对饲喂HF/HS饮食小鼠体重（D）、白色脂肪组织质量（E）及门静脉GIP和GLP-1水平（F）的影响（n = 9个生物学重复）。体重的统计学显著性通过混合效应模型分析并结合?idák多重比较检验评估（A和D），脂肪组织质量及GIP和GLP-1水平通过Welch校正的非配对t检验分析（B、C、E和F）。

(G) 通过16S rRNA基因测序确定的主要微生物门的相对丰度。数值代表每个样本的平均比例（n = 4–8个生物学重复）。

(H) 各组肠道微生物的α多样性（Shannon指数和Faith's PD）。差异使用Mann-Whitney U检验评估（n = 4–8个生物学重复）。

(I) 基于Bray-Curtis距离的肠道菌群组成主坐标分析（PCoA）；统计学显著性通过成对PERMANOVA评估（n = 4–8个生物学重复）。

(J) 通过LEfSe鉴定的HF/HM + 阿卡波糖组与HF/HS + 阿卡波糖组之间差异丰度的细菌属（Kruskal-Wallis检验，*p < 0.05，**p < 0.01；LDA评分>2）（n = 4–8个生物学重复）。

(K) ko00500（淀粉和蔗糖代谢）的KEGG通路图，显示根据PICRUSt2预测的功能谱，HF/HS组与HF/HS + 阿卡波糖组之间差异丰度的KEGG直系同源物（n = 8个生物学重复）。KEGG直系同源物根据DESeq2分析获得的log2变化倍数着色（校正后p < 0.05），红色表示在HF/HS + 阿卡波糖组中富集，蓝色表示在HF/HS组中富集。

(L) HF/HS + 阿卡波糖样本中细菌属对EC 3.2.1.20和EC 2.7.1.1功能的相对贡献（%）（n = 8个生物学重复），由PICRUSt2贡献度分析估算。

(M) 自由采食条件下的门静脉SCFA浓度（n = 8个生物学重复）。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey多重比较检验评估。

(N) 粪便细菌DNA的特异性qPCR分析，比较HF/HM + 阿卡波糖组与HF/HS + 阿卡波糖组之间细菌物种的相对丰度（n = 8个生物学重复）。变化倍数相对于HF/HM + 阿卡波糖组计算。*p < 0.05，***p < 0.001，****p < 0.0001，由Mann-Whitney U检验确定。数据以均值±标准误表示。另见示意图S3和S4。

讨论

α-糖苷酶抑制剂（α-GI）被广泛用于管理2型糖尿病，通过抑制碳水化合物水解及其吸收来减轻餐后高血糖。此外，据报道α-GI还能调节肠促胰素分泌、肠道微生物SCFA产生以及改变肠道微生物组成和功能。然而，不同类型α-GI以及不同膳食碳水化合物如何塑造宿主-微生物组反应仍知之甚少。在本研究中，我们证明α-GI阿卡波糖不仅通过抑制宿主碳水化合物消化酶影响宿主代谢，还通过调节肠道微生物组发挥作用，且阿卡波糖的效果取决于共摄入二糖的类型。我们证明阿卡波糖（而非米格列醇）在联用麦芽糖饲喂小鼠时可阻断SCFA产生，提示阿卡波糖可能广泛干扰肠道微生物对麦芽糖的利用。支持这一观点的是，我们发现阿卡波糖（而非米格列醇）在体外可抑制细菌在麦芽糖上的生长。具体而言，阿卡波糖诱导的大肠杆菌生长抑制需要转运麦芽糖和麦芽糖糊精的LamB，表明阿卡波糖在进入周质空间后被抑制了对麦芽糖的利用。尽管此前研究显示阿卡波糖会损害拟杆菌属的碳水化合物代谢，并且认为其通过LamB转运或抑制细胞质酶，但活细菌中阿卡波糖胞质转运的直接证据一直缺乏。我们的结果与未代谢阿卡波糖在细胞内积累并导致大肠杆菌下游糖酵解过程受抑一致。该效应可能有助于破坏MalQ介导的葡聚糖重塑和MalP依赖的磷酸解，从而损害细胞质麦芽糖糊精代谢。尽管我们在体外实验中使用2 mM阿卡波糖浓度超过了临床剂量（假设100 mg剂量溶解于据报道的餐后胃容积约580 mL中）估算的餐后肠腔浓度（约0.27 mM），但阿卡波糖对生长的抑制不太可能是由非特异性抗菌活性所致。这一解释与大肠杆菌在葡萄糖培养下及肺炎克雷伯菌在蔗糖培养下未见生长抑制一致。此外，另一种含维利胺基的α-GI伏格列波糖并未抑制大肠杆菌的麦芽糖依赖性生长，提示阿卡波糖的作用可能由其含维利胺基的结构特性介导。我们进一步确定蔗糖孔蛋白ScrY可以转运阿卡波糖。然而，阿卡波糖并未抑制肺炎克雷伯菌的蔗糖代谢；相反，它促进了细菌生长。由于格里蒙特克雷伯菌已通过一种称为阿卡波糖偏好性葡萄糖苷酶的α-葡萄糖苷酶水解阿卡波糖，肺炎克雷伯菌也可能具有物种特异性机制来利用阿卡波糖。与此可能性一致的是，阿卡波糖在蔗糖条件下增强了肺炎克雷伯菌的生长且无明显延迟。相比之下，在麦芽糖条件下，它延迟了生长但最终提高了最终产量。这些实验旨在确立ScrY在阿卡波糖进入细胞中的机制性作用，而非模拟共生肠道微生物中的蔗糖代谢。因此，本文中肺炎克雷伯菌仅作为基因工具用于显示ScrY可转运阿卡波糖，而非用于模拟健康肠道行为的模型。

然而，值得注意的是，在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中观察到的阿卡波糖碳水化合物类型依赖性效应，在体内小鼠肠道微生物中得以重现：阿卡波糖在联用麦芽糖时未能增加SCFA产生，但在联用蔗糖时却增加了SCFA产生。与这些发现一致的是，阿卡波糖在哺乳动物中的生物学作用不仅限于对宿主消化酶的抑制作用，还包括调节肠促胰素分泌，这可能是由于代谢蔗糖的微生物菌群产生SCFA所致。GIP信号降低和GLP-1信号升高被认为有助于保护哺乳动物免受饮食诱导的肥胖（DIO）影响，其分泌可能受SCFA信号调节。与此观点一致的是，阿卡波糖与蔗糖长期联用可大幅保护小鼠免受DIO，并伴随门静脉丙酸盐和丁酸盐水平升高、GIP水平下降和GLP-1水平升高。相比之下，在HF/HM喂养下阿卡波糖的这些效应基本被削弱，提示阿卡波糖诱导的肠道微生物组成和代谢功能的差异性改变是造成这些不同结果的潜在原因。

肥胖的特征是由慢性能量正平衡驱动的过量脂肪组织积累。大量证据表明，长期高饱和脂肪摄入（通常见于西式饮食）促成了全球肥胖流行率的上升。高脂肪饮食喂养常与Firmicutes与Bacteroidota（F/B）比值升高相关，尽管这种变化代表肥胖的原因还是后果仍有争议。尽管阿卡波糖对F/B比值的影响相似，但HF/HM与HF/HS饮食之间存在明显的抗肥胖效应差异，提示F/B比值的变化不太可能在本研究中导致DIO的发生。另一种可能是，包括拟杆菌属、Akkermansia菌属和副消化链球菌属在内的多个细菌属在HF/HS中（而非HF/HM中）被阿卡波糖显著增加，提示这些分类群可能有助于抗肥胖作用。功能预测进一步表明阿卡波糖选择性增强了HF/HS中微生物的淀粉和蔗糖代谢，其中拟杆菌属代表了这种代谢能力的最大预测贡献者，与HF/HS + 阿卡波糖组中观察到的门静脉丙酸盐和丁酸盐显著升高的蔗糖特异性现象一致。Brown等人报道，在淀粉模型中椭圆拟杆菌对阿卡波糖的敏感性低于_thetaiotaomicron拟杆菌。扩展这一观察结果，我们的特异性qPCR显示，与HF/HM + 阿卡波糖组相比，HF/HS + 阿卡波糖组中椭圆拟杆菌富集，提示肠腔蔗糖滞留在该物种慢性阿卡波糖治疗期间提供了选择优势。此外，Li等人近期证明副消化链球菌来源的丙酸盐介导了阿卡波糖在高脂肪饮食小鼠中的代谢益处。鉴于粪便副消化链球菌已被报道为非糖解菌，粘蛋白嗜极菌则优先利用宿主来源的粘蛋白而非膳食碳水化合物，因此它们的富集不太可能直接源于蔗糖利用。相反，它们与门静脉丙酸盐浓度升高一同富集，提示阿卡波糖诱导的肠腔蔗糖可用性可能直接通过拟杆菌属促进丙酸盐产生，并间接通过副消化链球菌属和Akkermansia菌属促进丙酸盐产生，后者可能涉及代谢互作，潜在包括交叉喂养。尽管HF/HS + 阿卡波糖组中门静脉丁酸盐浓度显著升高，但本研究未能确定其细菌贡献者。PICRUSt2预测未分类的Clostridia UCG-014分类群（在HF/HS + 阿卡波糖组中显著富集）可能参与从蔗糖代谢下游产生的乙酰-CoA生成丁酸盐（图S5）；然而，其物种身份和功能能力仍未明确。未来需要使用无菌动物模型的研究来确定单个细菌分类群及其代谢互作对阿卡波糖介导的抗肥胖作用的因果贡献。

总之，我们的发现表明阿卡波糖抑制蔗糖消化可使肠道微生物代谢蔗糖，从而增加小鼠中微生物来源的因素，包括SCFA。随后SCFA信号增加被认为可抑制GIP分泌并促进GLP-1分泌，共同有助于保护机体免受DIO影响。除膳食脂肪外，过量的精制糖摄入也与全球肥胖率上升相关，这在我们HF/HS和HF/HM模型中得到支持。值得注意的是，阿卡波糖的抗肥胖作用在富含蔗糖的饮食下比在富含麦芽糖的饮食下更为显著，提示与阿卡波糖共摄入的蔗糖可能作为益生元发挥作用，增强微生物发酵和SCFA产生。一旦肥胖已经发展，对自身摄入过多脂肪和糖的自控往往困难。因此，蔗糖与阿卡波糖的组合可能为肥胖管理提供有前景的治疗策略。未来还需要进一步研究以阐明阿卡波糖在高脂肪和高蔗糖饮食条件下抗肥胖作用的分子和微生物机制。

本研究的局限性

本研究的若干局限性值得考虑。

首先，虽然大肠杆菌实验提供了概念验证，证明阿卡波糖可以以麦芽糖依赖的方式被摄取，并抑制细菌的麦芽糖代谢，但大肠杆菌并不能代表肠道微生物群落的复杂性。因此，这些发现在体内的相关性仍有待建立。其次，高脂高蔗糖饮食加阿卡波糖（HF/HS + acarbose）引起了肠道微生物组、门静脉短链脂肪酸、GIP和GLP-1水平的显著变化，其中每一种因素都可能对观察到的抗肥胖效果有贡献；然而，各因素的因果贡献无法完全区分。需要使用无菌或已知菌群的实验鼠来直接证明微生物群在这些表型中的作用。第三，我们的微生物组分析支持阿卡波糖促进微生物蔗糖代谢和短链脂肪酸产生；然而，这些发现基于16S rRNA测序、基于PICRUSt2的功能预测以及物种特异性qPCR，因此并不能直接评估微生物的转录和酶活性，或代谢通量。最后，虽然阿卡波糖是一种已确立的临床药物，但在将本研究发现外推至人类时需谨慎，因为高脂高蔗糖模型并不能完全重现西方化饮食模式，且小鼠肠道微生物群与人类存在显著差异。因此，需要在设计适当的临床研究中进一步验证。

**资源可用性**

**通讯联系人**
如需进一步信息和资源，请联系通讯联系人Takashi Miki（[e-mail]），他将负责满足相关需求。

**材料可用性**
本研究未生成新的独特试剂。

**数据和代码可用性**
- 本研究产生的16S RNA测序和宏基因组分析数据集可在NCBI数据库中获取，BioProject编号：PRJNA1453709。
- 本文未报告原始代码。
- 如需重新分析本文数据的任何其他原始数据和信息，可向通讯联系人索取。

**致谢**
本研究得到日本文部科学省科学研究费补助项目资助（24K10023给EL，20K08583给RH，25K02439给TM），以及日本科学技术振兴机构下一代开创性研究支持项目（SPRING）资助，项目编号JPMJSP2109（HY）。本研究部分得到木川橡胶工业株式会社（日本千叶）的资金支持。

**作者贡献**
H.Y.、E.L.和T.M.设计了研究方案，分析了数据，撰写了论文。H.Y.和E.L.进行了实验。R.H.分析和解释了数据。A.T.构建了细菌突变体并分析了数据。A.E.进行了代谢组学分析。J.M.和I.K.进行了门静脉血浆短链脂肪酸的测定。Y.G.进行了细菌培养实验。Y.T.和T.T.进行了计算结构分析。T.M.是本工作的保证人，作为保证人，他完全获取了研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。所有作者均审阅并批准了该论文。

**利益声明**
作者声明不存在利益冲突。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 抗RNA聚合酶β抗体 | abcam | 货号：EPR18704；RRID: AB_3076167 |
| LAMB多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 货号：PA5-144472；RRID: AB_3091635 |
| 抗兔IgG，HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 货号：7074；RRID: AB_2099233 |
| **细菌和病毒菌株** | | |
| 大肠杆菌DH5α | 本实验室保存 | N/A |
| 大肠杆菌W3110 | 本实验室保存 | N/A |
| 肺炎克雷伯菌Kpc01 | Yamanaka等人 | N/A |
| 大肠杆菌W3110 ΔlamB | 本文 | N/A |
| 大肠杆菌W3110 ΔlamB/pscrY | 本文 | N/A |
| 大肠杆菌W3110 ΔlamB/plamBEc | 本文 | N/A |
| 大肠杆菌W3110 ΔlamB/plamBKp | 本文 | N/A |
| **生物样本** | | |
| 小鼠血浆 | 本文 | N/A |
| 小鼠粪便 | 本文 | N/A |
| 小鼠脂肪组织 | 本文 | N/A |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| 阿卡波糖 | 东京化学工业 | 货号：A2485 |
| 米格列醇 | 东京化学工业 | 货号：M2302 |
| 伏格列波糖 | 东京化学工业 | 货号：V0119 |
| 麦芽三糖 | Cayman Chemical | 货号：20306 |
| 麦芽四糖 | 长濑维他命公司 | 货号：MA141 |
| 麦芽六糖 | Apollo Scientific | 货号：BIM1013 |
| 二肽抑肽酶A | 肽研究所 | 货号：4132 |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 货号：4385612 |
| **关键商业检测** | | |
| 活性GLP-1检测试剂盒 | Millipore | 货号：EGLP-35K |
| 大鼠/小鼠总GIP ELISA试剂盒 | Millipore | 货号：EZRMGIP-55K |
| EnzytecTM液体乙酸检测试剂盒 | R-Biopharm | 货号：E8226 |
| **沉积数据** | | |
| 16S rRNA测序（原始序列数据） | 本文 | BioProject: PRJNA1453709 |
| **实验模型：生物体/菌株** | | |
| 小鼠：C57BL/6J | CLEA日本株式会社 | N/A |
| **寡核苷酸** | | |
| 寡核苷酸序列 | 见表S3和S4 | 本文 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| QIIME 2 | QIIME 2 | 版本2024.10 |
| PICRUSt2 | Douglas等人 | 版本2.5.3 |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software, LLC | 版本10.4.1 |
| R统计计算基金会 | R Foundation for Statistical Computing | 版本4.4.0 |
| R studio | Posit | 版本2026.05.0 + 218 |
| MS-DIAL | Tsugawa等人 | 版本4.9.221218 |
| **其他** | | |
| 小鼠：普通饲料 | CLEA日本株式会社 | CE-2 |
| 小鼠：高脂高蔗糖饮食（45% kcal来自脂肪） | Research Diet Inc. | D12451 |
| 小鼠：高脂高麦芽糖饮食（45% kcal来自脂肪） | Research Diet Inc. | N/A |
| 小鼠：高脂饮食（54% kcal来自脂肪） | Research Diet Inc. | N/A |
| 小鼠：高脂果糖/葡萄糖饮食 | 本文 | N/A |
| 融合成像站 | Vilber Lourmat | FUSION-FX7 |

**实验模型和研究参与者详细信息**

**实验模型**

**动物**
野生型雄性C57BL/6J小鼠购自CLEA日本株式会社（日本东京）。小鼠饲养在温控房间中，温度23 ± 3°C，湿度55 ± 15%，12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水。小鼠被分配至以下饮食之一：普通饲料（ND）（CE-2；12.1% kcal来自脂肪；CLEA日本）；高脂高蔗糖饮食（HF/HS）（45% kcal来自脂肪和17% kcal来自蔗糖；D12451；Research Diets, Inc., 美国新泽西州新不伦瑞克）；高脂高麦芽糖饮食（HF/HM）（45% kcal来自脂肪和17% kcal来自麦芽糖；D22122002，改良版D12451配方）；高脂饮食（HF）（54% kcal来自脂肪；D12451px13，改良版D12451配方）；或补充等摩尔葡萄糖和果糖混合物的高脂饮食（HF + glc/fru）（45% kcal来自脂肪，葡萄糖和果糖各8.5% kcal）。α-糖苷酶抑制剂阿卡波糖（1,000 ppm）（东京化学工业株式会社，日本东京）被添加到HF/HS（HF/HS + acarbose）、HF/HM（HF/HM + acarbose）、HF（HF + acarbose）或HF + glc/fru（HF + glc/fru + acarbose）饮食中。除ND外，所有实验饮食的营养成分见表S2。饮食干预在小鼠6周龄时开始，持续6周。各实验的样本量在相应图注中标明。所有动物实验均经日本千叶大学动物护理和使用委员会批准（批准号7-139和8-105），并按机构指南进行。

**细菌菌株**
肺炎克雷伯菌Kpc01为来自本实验室的血流临床分离株。肺炎克雷伯菌Kpc01和大肠杆菌W3110用于突变体构建和竞争实验，大肠杆菌DH5α用于竞争实验和常规质粒克隆。除特别说明外，菌株在LB培养液（Invitrogen, Life Technologies, 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）中于37°C剧烈振荡过夜培养。常规培养期间不添加抗生素。维持质粒时使用50 μg/mL氨苄青霉素。细菌菌株以15%甘油菌液在-80°C保存。本研究使用的所有菌株见表1。

**方法细节**

**饲喂状态下门静脉肠促胰素测定**
饮食干预6周后，用异氟烷麻醉小鼠，在上午10:00（对应于饲喂状态，即光照开始后4小时）采集门静脉血（约600 μL）。血液样本立即与EDTA（终浓度0.15%）和二肽抑肽酶A（终浓度3 mM）（肽研究所，日本大阪）混合，以防止肽降解。通过离心分离血浆（2,000×g，15分钟，4°C），并在-80°C保存直至分析。使用胰高血糖素样肽-1（活性）ELISA试剂盒（Millipore, Billerica, MA, USA）和大鼠/小鼠总GIP ELISA试剂盒（Millipore, Billerica, MA, USA）测定血浆肠促胰素浓度，按照制造商说明进行。

**二糖挑战后急性肠促胰素分泌**
禁食16小时后，口服给予二糖（麦芽糖或蔗糖；2 g/kg），给予或不给予阿卡波糖（40 mg/kg）。给药30分钟后采集门静脉血，测定血浆GIP和GLP-1水平。

**体内门静脉短链脂肪酸（SCFA）测定**
口服给予麦芽糖或蔗糖（2 g/kg）后30分钟测定门静脉SCFA浓度，同时给予或不给予α-糖苷酶抑制剂（阿卡波糖40 mg/kg，或米格列醇10 mg/kg；东京化学工业株式会社，日本东京）。这些剂量基于初步口服麦芽糖耐受试验确定（图S1）。麦芽糖挑战实验中，主要比较组为麦芽糖+阿卡波糖组和麦芽糖+米格列醇组（每组n = 8），麦芽糖单独组（n = 4）用于评估麦芽糖给药后血糖反应的抑制情况。蔗糖和麦芽糖比较中，主要比较组为蔗糖+阿卡波糖组和麦芽糖+阿卡波糖组（每组n = 12）。此外，还测定了饮食干预6周后门静脉SCFA浓度，使用上午10:00采集的样本（饲喂状态；光照开始后4小时；每组n = 8）。对照组和麦芽糖+米格列醇组的数据与本团队之前发表的研究（Ma等人，2022）相同，此处展示用于比较。尽管这些数据已发表，但它们来源于与当前数据相同的实验，仅用于在图1B中进行比较。SCFA水平通过气相色谱-质谱联用（GC-MS；GCMS-QP2010 Ultra，岛津，日本京都）测定，方法如前所述。简言之，使用VF-WAXms毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，1 μm膜厚；Agilent Technologies）进行色谱分离，以氦气为载气（0.92 mL/min）。质谱在扫描模式（m/z 40-130）下运行，并使用外标校准进行SCFA定量时采用选择离子监测模式。

**大肠杆菌W3110 ΔlamB菌株构建**
使用λ-Red重组系统构建大肠杆菌W3110 ΔlamB突变株。将pKD46转化大肠杆菌W3110，在添加氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB中于30°C维持。诱导λ-Red重组时，在0.2%（w/v）L-阿拉伯糖存在下培养至OD600约为0.5，制备电感受态细胞。使用引物对lamB-P1-F（5′-acacaaagcctgtcacaggtgatgtgaaaaaagaaaagcaatgactcagggtgtaggctggagctgcttc-3′）/lamB-P1-F（5′-ggcgttggttgccgaatgcggcgtaaacgccttatccggcccaggttttgcatatgaatatcctccttag-3′）从pKD3中PCR扩增携带氯霉素抗性卡匣的线性DNA片段。通过电转化将PCR产物导入诱导细胞中，在含氯霉素（20 μg/mL）的LB琼脂上于37°C筛选重组体。使用引物lamB-check-F（5′-ggtgccacattcgctatcgg-3′）和lamB-check-R（5′-acatttgacagccgttgtag-3′）通过菌落PCR确认目标位点的正确整合。为了去除标记，将pCP20导入重组菌株以移除氯霉素卡匣，并通过氯霉素敏感性试验和PCR验证卡匣的丢失。

**质粒构建**
使用引物对KpnI-srcY-F（5′-ccgggtaccagcacactcactgatttacc-3′）/EcoRI-srcY-R（5′-agtgaattccacgtcagaaccaagtctcc-3′）、KpnI-EclamB-F（5′-ccgggtaccagcctgtcacaggtgatgtg-3′）/EcoRI-EclamB-R（5′-agtgaattcgctattaccaccagatttcc-3′）和KpnI-Kp_lamB-F（5′-ccgggtacccgatataccggcgaagcgtg-3′）/EcoRI-Kp_lamB-R（5′-agtgaattcggtattaccaccacacttcc-3′），分别PCR扩增大肠杆菌W3110中的srcY和lamB编码序列以及肺炎克雷伯菌Kpc01中的lamB。将PCR产物连接至载体pMW119中，构建pMW119-srcY（psrcY）、pMW119-lamBEc（plamBEc）和pMW119-lamBKp（plamBKp）。将所得质粒导入大肠杆菌ΔlamB菌株中。

**大肠杆菌在不同糖类中的培养**
将大肠杆菌过夜培养物在M9培养基中重悬至OD600为0.1。M9培养基中补充0.2%（w/v）硫胺素、2 mM MgSO4和0.1 mM CaCl2，并酌情添加0.5%（w/v）麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽六糖、葡萄糖或蔗糖作为碳源。实验在有无α-糖苷酶抑制剂（2 mM米格列醇、2 mM阿卡波糖或2 mM伏格列波糖）的条件下进行。培养物在37°C振荡培养，按图中标注的时间点测定OD600值。

**培养基中乙酸的测定**
为评估大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的乙酸产生，收集培养样本并在4°C下以2,000×g离心10分钟。所得上清液使用乙酸检测试剂盒（R-Biopharm AG, 德国达姆施塔特）按照制造商说明测定乙酸浓度。

**定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分析**
将大肠杆菌W3110在M9/麦芽糖培养基中培养6小时，洗涤后在无碳水化合物M9培养基中添加阿卡波糖单独处理（2 mM或25 mM），于37°C孵育15分钟。使用ISOGEN（富士胶片和光纯药株式会社，日本大阪）从各培养物中提取总RNA。合成互补DNA（cDNA），并使用Fast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems, Waltham, MA, USA）进行定量PCR（qPCR），按照制造商说明操作。通过RT-qPCR分析麦芽糖操纵子中基因的表达。引物序列见表S3。

**质谱分析**
在LB肉汤中过夜培养后，将大肠杆菌W3110在M9/麦芽糖中预培养6小时。然后将细胞洗涤一次，转移至以下三种条件之一：无碳源的M9培养基（M9/-）、M9/麦芽糖，或补充阿卡波糖的M9/麦芽糖。将OD600为0.1的细胞孵育1小时，收获后在液氮中速冻，并在-80°C保存直至提取。每个条件制备3个独立生物学重复（n = 3）。

代谢物提取采用基于Carvalho等人的描述进行修改的方案。将冷冻沉淀物重悬于冰浴预冷的80%（体积/体积）甲醇中（?20°C），浓度相当于每毫升200毫克湿细胞重量。加入不锈钢微珠（直径0.6毫米），通过五个循环的剧烈涡旋振荡（每次30秒）和冰上孵育（每次30秒）进行细胞破碎。通过离心（4,000×g，10分钟，4°C）去除碎片，上清液随后按照之前描述的方法进行超高效液相色谱-定量飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析（Eguchi等人；Takeda等人）。分析使用ExionLC AD UPLC系统与X500R LC-QToFMS系统（SCIEX）联用，采用全理论碎片离子质谱序列窗口采集（SWATH）方法。一个占空周期包括一次MS扫描（200毫秒），随后进行一系列产物离子扫描（每次40毫秒），跨越30个隔离窗口（m/z 50-800）。MS/MS谱图在35 eV（±15 eV）下采集。色谱分离使用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z柱（2.7微米，50×2.1毫米）在之前报告的梯度条件下进行。离子化分别在正离子模式和负离子模式下进行。数据处理使用MS-DIAL（版本4.9.221218）和R（版本4.4.0）完成。对于相对定量，每个已鉴定代谢物的峰面积用于组间比较。谱图与公共库匹配，包括MS-DIAL MSP、北美质谱库和NIST20。根据Schymanski等人提出的标准，基于谱库中最高评分的匹配结果（截断评分为80），将代谢物注释分配至Level 2。在检测到的葡聚糖中，麦芽五糖通过直接谱图匹配被鉴定为Level 2，而其他寡聚糖则根据其MS/MS特征和对应于己糖单元的表征质量差异（162.05 Da）被分配为Level 3，但未解析特定的糖苷键连接方式。阿卡波糖的鉴定通过标准品确认。Western blotting实验：将大肠杆菌W3110、ΔlamB和ΔlamB/lamBEc菌株在补充0.5%（w/v）麦芽糖或葡萄糖的M9最小培养基中培养6小时，达到对数中期。通过离心收集细胞，在Laemmli样品缓冲液中裂解，随后进行超声破碎并在100°C煮沸5分钟。蛋白裂解液（5微升）通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜分别与抗RpoB（EPR18704，Abcam；1:2,000）和抗LamB（PA5-144472，Thermo Fisher Scientific；1:2,000）的一抗孵育，随后加入HRP偶联的抗兔二抗（#7047，Cell Signaling Technology；1:10,000）。免疫反应信号使用FUSION-FX7成像系统（Vilber Lourmat，法国Collégien）检测并定量。对接模拟：使用MalQ与阿卡维亚糖-葡萄糖-阿卡波糖（AGA）复合物（PDB 4S3R）和MalP与α-阿卡波糖复合物（PDB 2ECP）的晶体结构。MalQ或MalP与麦芽寡糖或阿卡波糖之间的分子对接使用AutoDock Vina（AutoDockTools v1.5.6）进行。对接得分以结合能（千卡/摩尔）报告，数值越低表示相互作用越稳定；选择最低能量构象用于进一步分析。根据几何标准识别配体与氨基酸残基之间的预测氢键或距离，并测量相应的距离（?）。分子图形和可视化使用PyMOL（Schr?dinger，LLC）生成。16S rRNA基因测序肠道微生物组成分析：在长期饮食干预结束时排便后立即采集粪便，立即冷冻并储存于?80°C直至分析。按照制造商说明使用FastDNA SPIN Kit for Feces（MP Biomedicals，CA，美国）提取总细菌DNA。使用引物515F（5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）通过PCR扩增细菌16S rRNA基因的v4高变区。扩增产物使用AMPure XP磁珠（Beckman Coulter，CA，美国）纯化，并在Illumina MiSeq平台（Illumina，CA，美国）上使用MiSeq Reagent Kit v3进行双端测序。原始测序数据使用QIIME 2（版本2024.10）处理。序列经过质量过滤、去噪和合并，生成扩增子序列变体（ASVs）。分类学注释使用SILVA 138数据库（silva-138–99-nb-classifier）完成。Alpha多样性指标和基于Bray-Curtis距离的Beta多样性分析在QIIME 2中进行计算，主坐标分析（PCoA）用于可视化。使用线性判别分析效应量（LEfSe）鉴定差异富集的类群，如正文所述。基于PICRUSt2的功能预测分析：使用PICRUSt2（v2.5.3）从16S rRNA基因测序数据预测肠道微生物群的功能谱。使用DESeq2比较HF/HS与HF/HS +阿卡波糖小鼠之间、以及HF/HM与HF/HM +阿卡波糖小鼠之间的预测KEGG直系同源物（KO）丰度。使用KEGG Mapper鉴定并可视化KEGG淀粉和蔗糖代谢（ko00500）通路中差异丰度的KO。KEGG通路图的复制许可从Kanehisa实验室获得。KEGG图中展示的信息基于KEGG数据库。为鉴定HF/HS +阿卡波糖样品中贡献预测代谢功能的细菌类群，使用pred_metagenome_contrib.tsv输出进行PICRUSt2贡献分析。对于参与蔗糖代谢的EC 3.2.1.20和EC 2.7.1.1，将归一化的类群功能贡献在属水平上聚合，并计算每个属的相对贡献。对于与已知丙酸产生通路和丁酸产生通路相关的EC，将贡献值在属水平上聚合，并计算每个类群的相对贡献。肠道微生物群的物种特异性定量PCR分析：进行物种特异性定量PCR（qPCR）以验证16S rRNA基因测序分析鉴定的细菌类群。将分配到Bacteroides（拟杆菌属）、Parasutterella（拟普氏菌属）和Akkermansia（拟杆菌属）的代表性扩增子序列变体（ASVs）进行BLAST分析，以鉴定最匹配的近缘细菌物种。相应的ASV序列和序列一致性总结在表S1中。qPCR使用从粪便样本中提取的细菌DNA进行，每个细菌物种的相对丰度使用ΔΔCt方法以通用细菌16S rRNA基因扩增进行归一化后计算。物种特异性引物序列列于表S4中。细菌丰度的相对变化以HF/HS +阿卡波糖小鼠相对于HF/HM +阿卡波糖小鼠的倍数变化表示。定量和统计分析：所有定量数据表示为均值±标准误，除非另有说明。统计分析使用GraphPad Prism软件（版本8.0）进行。两组之间的比较使用非配对双尾Student's t检验。当方差不同时，应用Welch校正。物种特异性细菌qPCR数据使用Mann-Whitney U检验进行分析，因为相对丰度数据不满足参数检验的假设。涉及两组以上的比较使用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey多重比较检验，或在适当的情况下使用Kruskal-Wallis检验后接Dunn多重比较检验。统计细节，包括样本量（n）、n的定义、统计检验以及中心、分散和精度的度量，在相应的图注中提供。p值<0.05被认为具有统计学显著性。补充信息（2）下载所有PDF（4.71 MB）文档S1。图S1-S5和表S2-S4、数据S1及补充参考文献电子表格（12.44 KB）表S1。基于BLAST从ASV序列鉴定的细菌物种，与图5相关