高频rTMS改善MCAO/R大鼠脑缺血/再灌注损伤并调控mTOR相关信号及脑–肠–免疫表型

《Brain Research Bulletin》：High-frequency rTMS attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury and modulates mTOR-related signaling and brain–gut–immune phenotypes in MCAO/R rats

　　

高频重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS）可减轻脑缺血/再灌注损伤，并调控MCAO/R大鼠mTOR相关信号及脑–肠–免疫表型。高频rTMS可改善神经运动功能恢复并减轻梗死损伤；rTMS可增加FGF-2、BDNF及p-mTOR（Ser2448）/mTOR比值；rTMS可减轻MCAO/R后Beclin-1、LC3-II/LC3-I及p62的异常变化；rTMS可降低MCAO/R后血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平；rTMS相关的肠道菌群变化与运动及炎症表型相关。研究人员构建右侧大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R）大鼠模型，于术后第3–7天和第9–13天给予20 Hz、100%静息运动阈值、每日1000脉冲的高频rTMS干预。结果显示，高频rTMS显著降低Longa评分和改良神经严重程度评分（modified neurological severity score, mNSS），提高患肢使用率、握力和网格悬挂评分，并减少TTC染色所示梗死体积。组织学显示rTMS减轻皮层和纹状体病理损伤，增加尼氏阳性神经元数量并降低TUNEL阳性细胞比例。Western blot和免疫荧光显示，rTMS上调FGF-2、BDNF及p-mTOR（Ser2448）/mTOR比值，同时下调Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值和p62表达。ELISA显示rTMS降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。16S rRNA基因测序显示，rTMS未改变α多样性，但显著改变β多样性结构和属水平菌群组成，富集Lactococcus、Faecalibaculum等属，并降低Papillibacter等属；RDA、Procrustes、MaAsLin2及Spearman相关分析提示特定菌属与神经运动和炎症指标存在关联。研究表明，高频rTMS可减轻MCAO/R后脑缺血/再灌注损伤并促进神经功能恢复，其机制可能涉及增强神经营养支持、改善mTOR相关自噬标志物异常表达及减轻外周促炎状态。

**论文解读：高频rTMS对MCAO/R大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及mTOR相关信号与脑–肠–免疫表型调控**

**一、研究背景与科学问题**

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中最为常见。虽然血管再通治疗（如静脉溶栓和机械取栓）改善了部分患者的急性期预后，但再灌注后仍可继发氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、血脑屏障破坏和程序性细胞死亡，进一步加重脑组织损伤并限制神经功能恢复。自噬在脑缺血/再灌注损伤中发挥阶段依赖性和双向调控作用：适度自噬可清除受损细胞器及异常蛋白，而持续过度激活或自噬流障碍则加重神经元损伤。mTORC1是调控自噬起始、细胞代谢和蛋白质稳态的关键信号节点，其功能异常可扰乱自噬相关过程并影响缺血后神经元存活。此外，FGF-2和BDNF等神经营养因子参与神经元存活、突触可塑性和损伤修复，并可能通过mTOR相关信号网络调节自噬。重复经颅磁刺激（rTMS）作为一种非侵入性神经调控技术，可促进卒中后功能恢复，但rTMS是否能通过调节mTOR相关信号影响自噬从而减轻脑缺血/再灌注损伤，尚缺乏系统证据。同时，脑卒中后肠道菌群组成可发生显著变化，肠道菌群失调可能通过影响肠道屏障、微生物代谢物和外周免疫状态促进TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子释放，加重神经炎症和脑损伤。rTMS作为局部脑刺激技术，其生物学效应是否伴随肠道菌群重塑和外周炎症减轻，仍需进一步研究。

**二、研究设计与技术方法**

研究人员使用雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠建立右侧大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，共66只大鼠，其中3只用于术中激光散斑成像（LSCI）定性验证血流变化，其余63只随机分为Sham组（18只）和MCAO/R建模组（45只），建模后死亡5只（死亡率11.1%），再经Longa评分筛选排除4只，最终MCAO/R模型大鼠36只，随机分为MCAO/R组和MCAO/R+rTMS组，每组18只。每组中3只用于TTC染色，8只用于行为学、ELISA和16S rRNA测序（其中6只另用于HE、尼氏、TUNEL和免疫荧光染色，2只用于Western blot），另7只用于Western blot，最终Western blot每组n=9。rTMS干预参数为20 Hz、100%静息运动阈值（RMT）、每日1000脉冲，于术后第3–7天和第9–13天共10次。主要技术方法包括：激光散斑对比成像、Longa评分和改良神经严重程度评分（mNSS）、圆柱体测试、握力测试、网格悬挂测试、TTC染色、HE染色、尼氏染色、TUNEL检测、Western blot、免疫荧光（采用TSA顺序标记双标）、ELISA检测血清炎症因子、16S rRNA基因测序（V3–V4区，Illumina MiSeq平台）及PICRUSt2功能预测，并采用RDA、Procrustes、MaAsLin2和Spearman相关进行关联分析。

**三、主要研究结果**

**（一）高频rTMS改善MCAO/R后神经运动功能并减轻脑梗死**

LSCI显示MCAO期间同侧皮层灌注显著下降，再灌注后部分恢复。术后第14天，rTMS组Longa评分显著低于MCAO/R组（P=0.0043）；mNSS在术后第7天和第14天分别降低2.750分和4.625分（P=0.0109和P=0.0004）。rTMS显著提高患肢使用率和峰值握力（均P<0.0001），并改善网格悬挂评分（P=0.0250）。TTC染色显示rTMS降低校正梗死体积百分比（P=0.0175）。治疗期间未见明显惊厥行为或死亡。

**（二）高频rTMS减轻组织病理损伤并降低TUNEL阳性率**

HE染色显示MCAO/R组皮层和纹状体出现组织紊乱、神经元固缩、核深染、空泡变性和水肿，rTMS后上述改变减轻。尼氏染色显示MCAO/R显著减少皮层和纹状体尼氏阳性神经元（均P<0.0001），rTMS则增加两区域阳性神经元数量（纹状体P=0.0180，皮层P<0.0001）。TUNEL染色显示MCAO/R组TUNEL阳性细胞比例升高（P=0.0212），rTMS显著降低该比例（P=0.0230），且rTMS组与Sham组无显著差异。

**（三）高频rTMS调节神经营养因子和自噬相关蛋白表达**

Western blot显示，与Sham组相比，MCAO/R组FGF-2和BDNF蛋白表达显著降低（P=0.0032和P=0.0001）；与MCAO/R组相比，rTMS组两者均显著升高（P=0.0104和P=0.0074）。MCAO/R组p-mTOR（Ser2448）/mTOR比值较Sham组显著降低（P=0.0007），rTMS组较MCAO/R组显著升高（P=0.0093），而总mTOR表达无组间差异。MCAO/R组Beclin-1、p62表达和LC3-II/LC3-I比值均显著升高（P=0.0017、P=0.0003和P=0.0045），rTMS组上述三项指标均显著降低（P=0.0003、P=0.0004和P=0.0006）。

**（四）免疫荧光验证组织空间表达**

免疫荧光双标染色显示，MCAO/R后BDNF、FGF-2和p-mTOR（Ser2448）荧光强度降低（P=0.0054、P=0.0063和P=0.0004），LC3和p62强度升高（均P<0.0001）。rTMS显著增加BDNF、FGF-2和p-mTOR（Ser2448）强度（P=0.0005、P=0.0026和P=0.0010），并降低LC3和p62强度（均P<0.0001），与Western blot结果一致。

**（五）高频rTMS降低血清促炎细胞因子水平**

ELISA显示，MCAO/R组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平较Sham组显著升高（P=0.0112、P=0.0126和P=0.0140），rTMS组三种细胞因子均较MCAO/R组显著降低（P=0.0003、P=0.0003和P=0.0002），且rTMS组与Sham组无显著差异。

**（六）高频rTMS影响肠道菌群多样性和群落结构**

16S rRNA测序显示，三组间Shannon和Chao1指数无显著差异（P=0.1297和P=0.1100），α多样性未改变。基于加权UniFrac距离的PCoA显示三组分离，ANOSIM确认组间菌群结构差异显著（R=0.35255，P=0.002）。LEfSe显示MCAO/R组富集Lactobacillus、Faecalimonas、Streptococcus等属，Sham组富集Bacteroides、Akkermansia等属；rTMS组较MCAO/R组富集Lactococcus、Faecalibaculum、Christensenellaceae_R-7_group等属，而MCAO/R组富集Bacteroides、Papillibacter等属。PICRUSt2功能预测显示，MCAO/R与Sham组间存在多条KEGG通路差异，但MCAO/R与rTMS组间经FDR校正后无显著差异通路。

**（七）探索性关联分析**

RDA显示部分MCAO/R样本沿TNF-α、IL-1β和IL-6向量分布，而多数rTMS样本偏离该方向。Procrustes分析显示微生物结构矩阵与宿主表型矩阵显著一致（M2=0.023，R=0.9884，P=0.003）。MaAsLin2鉴定出多个与分组、运动功能和促炎因子相关的属。Spearman相关显示，Longa和mNSS评分与三种炎症因子正相关（ρ=0.502–0.646），与运动指标负相关；Lactococcus与峰值握力正相关（ρ=0.496，P=0.014），Papillibacter与TNF-α、IL-6正相关。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，高频rTMS在MCAO/R后产生功能和组织学获益，支持其在所试刺激条件下的神经保护效应。BDNF和FGF-2的升高以及p-mTOR（Ser2448）/mTOR比值的增加提示神经营养信号与mTOR相关通路可能存在交互作用，但未直接测量FGFR、TrkB、PI3K/Akt及下游mTORC1效应物，Ser2448磷酸化也不能等同于mTORC1活性，因此上下游关系尚未明确。Beclin-1、LC3-II/LC3-I和p62的同步升高可能反映自噬底物清除受损而非单纯自噬增强，由于仅测量静态自噬标志物，不能证明自噬流恢复或mTOR依赖性自噬机制。血清炎症因子降低表明外周促炎状态减轻，但不能代表中枢神经炎症被抑制。肠道菌群变化应视为生态学关联而非已证实的脑–肠机制，rTMS相关菌群改变呈现干预特异性而非简单恢复至Sham状态，且未观察到预测通路水平的显著功能变化。研究局限性包括仅测试单一高频rTMS参数、缺乏专门安全性评估（如EEG监测）、未进行认知功能评估等。结论认为，高频rTMS可减轻MCAO/R后脑缺血/再灌注损伤并促进神经功能恢复，其效应伴随神经营养支持增强、mTOR相关自噬标志物异常表达改善及血清促炎细胞因子水平降低，肠道菌群改变仍属探索性发现。该研究为高频rTMS在缺血性脑卒中神经修复中的应用提供了实验证据和潜在机制线索。