基于植物源生物墨水的免疫调节骨类器官构建方案

《iScience》：Protocol for fabricating immune-regulatory bone organoids via plant-based bioinks

骨类器官为研究骨骼发育、疾病和再生提供了三维系统。然而，许多现有的骨类器官系统未能充分整合免疫调节信号，尽管免疫调节在骨修复中起着核心作用。其转化潜力进一步受到动物源性基质（如Matrigel）使用的限制，这些基质具有异种性、成分不明确且批次间差异显著。为解决这些局限性，研究人员开发了一种不含Matrigel和外源性细胞因子的生物墨水，由芦荟凝胶（AV）、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和锂皂石（Laponite）组成。该配方通过提供可打印的细胞外基质样支架和内在的免疫调节信号，支持免疫调节骨类器官的构建。在体外实验中，该生物墨水促进持续的巨噬细胞重编程，并帮助建立支持骨类器官成熟的免疫微环境。在此，研究人员详细描述了制备含植物生物墨水、构建免疫调节骨类器官以及在颅骨缺损模型中评估其性能的分步方案。这一明确且可重复的平台为传统Matrigel基系统提供了实用的替代方案，并可能适用于其他免疫响应组织的工程化构建。

一、研究背景与现存问题

骨类器官作为一种三维培养体系，能够模拟天然骨组织的结构与功能，在骨骼发育、疾病建模及再生修复研究中展现出重要价值。然而，现有骨类器官系统普遍存在两大关键缺陷：其一，多数平台主要聚焦于成骨分化和基质矿化，而忽视了免疫调控在骨修复中的核心作用——特别是巨噬细胞从促炎M1表型向促再生M2表型的转变，这一过程对炎症消退、血管新生及成骨分化至关重要；其二，目前广泛使用的基底支架Matrigel来源于小鼠肉瘤细胞，其成分复杂且不明确、批次间差异大，严重制约了实验的可重复性和临床转化前景。因此，亟需开发一种成分明确、可重复且具备内在免疫调节能力的替代水凝胶基质。

二、研究内容、结论与意义

为解决上述问题，研究人员开发了一种不含Matrigel和外源性细胞因子（如IL-4）的复合生物墨水，其组成为甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、合成纳米锂皂石（Laponite）和芦荟凝胶（AV）。该生物墨水兼具可打印的细胞外基质样骨架和来自芦荟的天然免疫调节活性成分。通过优化配比（GelMA:Laponite:AV = 10%:1%:40%）及3D生物打印参数（打印温度8°C、气压0.2-0.3 MPa、打印速度4 mm/s、365 nm紫外光交联等），研究人员成功构建了负载骨髓间充质干细胞（BMSCs）的骨类器官前体。体外实验表明，该体系不仅支持BMSCs的成骨分化和基质矿化，还能持续诱导巨噬细胞向M2促再生表型极化。体内实验进一步证实，该类器官在裸鼠皮下可发育为骨样组织，并伴随血管化（CD31⁺）和免疫重塑；在大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中，其显著促进了功能性骨修复，且未观察到明显全身毒性。该研究的核心意义在于：首次提出了一种利用植物源组分实现免疫调节驱动的功能性成骨策略，为替代Matrigel基类器官系统提供了成分明确、可规模化且具转化潜力的新平台，并有望拓展至其他免疫敏感性组织的工程化构建。

三、关键技术方法

1. 1.
   芦荟凝胶提取与表征：从新鲜库拉索芦荟叶片中无菌剥离内层凝胶，经离心纯化后，采用凝胶渗透色谱（GPC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证多糖图谱及鉴定小分子生物活性成分。
2. 2.
   GelMA合成与验证：将明胶与甲基丙烯酸酐反应，经透析、冻干制得取代度约60%的GelMA粉末，并通过¹H-NMR确认产物纯度与取代度。
3. 3.
   复合生物墨水配制与3D生物打印：在无菌条件下按优化比例（10% GelMA、1% Laponite、40% AV）混合各组分，并将第5代大鼠BMSCs（来源：Cyagen Biosciences，广州）以1×10⁶ cells/mL密度封装其中；采用低温挤出式生物打印机（Bio-Architect SR），在8°C、0.2-0.3 MPa气压、4 mm/s速度下打印8层矩形多孔网格（5 mm × 5 mm），层间90°正交旋转，并以365 nm紫外光逐层交联。
4. 4.
   体内动物模型：使用8周龄雌性BALB/c裸鼠进行皮下异位植入（评估免疫-成骨重塑与血管化），以及8周龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=48）构建双侧5 mm临界尺寸颅骨缺损模型（评估骨修复效果与生物安全性）。

四、研究结果

1. 植物源生物墨水的开发与参数优化

通过系统性多参数评估（可打印性、结构保真度、力学性能、细胞存活率），确定了最佳配方为GelMA 10 wt%、Laponite 1 wt%、AV 40 vol%，此时打印系数Pr≈1.0，细胞活力>90%。优化后的打印参数（8°C、0.2-0.3 MPa、4 mm/s、5% UV强度）确保了连续纤维沉积和精确的三维结构。

2. 体外与体内免疫调节骨类器官的评价

• •
  体外评价：成功构建的骨类器官在14-28天内维持高细胞活力，表现出渐进性成骨分化（ALP染色阳性、ARS矿化结节阳性、成骨标志物OCN/RUNX2/OPN表达升高）和胞外基质沉积。同时，GelMA/Laponite/AV构建体能增强巨噬细胞招募与粘附，并促使巨噬细胞转向CD206阳性/iNOS低表达的M2表型。
• •
  体内皮下植入评价：在裸鼠皮下植入4周后，构建体发育为骨样组织，表现为有序的胞外基质组装（I型胶原、骨膜蛋白Periostin）、活跃的细胞-基质粘着斑（Vinculin）、高表达成骨标志物，以及micro-CT可检测的矿化基质。此外，观察到宏观血管浸润和内部CD31阳性微血管形成。免疫调节方面表现为IL-1β降低、IL-10升高及CD206阳性巨噬细胞增多。
• •
  大鼠颅骨缺损修复评价：术后8周，GelMA/Laponite/AV骨类器官组较对照组显示出更显著的矿化骨形成、与宿主组织更好的整合，以及修复部位CD206阳性巨噬细胞的富集，表明形成了促再生免疫微环境。主要脏器H&E染色和血液生化分析未发现明显全身毒性。

五、讨论与结论总结

讨论部分要点：

该平台的独特之处在于利用芦荟凝胶（AV）建立免疫指导性微环境，其促再生效应与Th1/Th2/Th17通路调节以及STAT6、NF-κB、PI3K/AKT、RANKL相关信号改变有关，但尚未建立直接的分子因果联系。未来需延长评估周期至12-24周，并在大型动物模型中验证长期基质重塑、血管稳定性和生物力学整合。该方法学还存在若干局限：主要模拟巨噬细胞介导的免疫调控，未纳入中性粒细胞、破骨细胞、T细胞等完整免疫细胞群；裸鼠模型限制了适应性免疫应答的评估；当前8周的观察期主要反映早期至中期的骨再生。未来可扩展应用于类风湿关节炎、骨质疏松等免疫失调骨科疾病建模，以及软骨、皮肤等其他免疫敏感性组织类器官的构建。

研究结论翻译：

总之，这种方法代表了扩大当前体外类器官平台功能范围和增强其结构复杂性的一种有前景的策略。研究人员预计，这些类器官技术的进步将有助于加深对疾病病理学的理解，推动新型疗法的发展，并促进功能性植入物的临床转化。