FKBP12与TMEM16A C端直接相互作用，支持TMEM16A受钙调神经磷酸酶（Calcineurin）调控的过程

《Cell Calcium》：Direct Interaction Between FKBP12 and the TMEM16A C-Terminus Supports Calcineurin-Dependent Regulation of TMEM16A

　　

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  FKBP12和钙调神经磷酸酶（CaN）调节重要的氯通道TMEM16A。
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  FKBP12与TMEM16A结合；这种相互作用随着细胞内Ca²⁺水平的升高而增强。
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  FKBP12直接与TMEM16A的羧基末端相互作用。
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  环孢素A和FK506以依赖于CaN的方式抑制TMEM16A。
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  FKBP12–CaN可能维持哺乳动物中必要的TMEM16A氯离子流动。

引言

TMEM16A是一种氯离子（Cl^-）通道，其活性由细胞质中游离Ca²⁺水平的升高触发，这种升高可以是G蛋白偶联受体（GPCRs）激活或Ca²⁺通道开放的结果[[1], [2], [3]]。然而，TMEM16A并不对游离的Ca²⁺产生反应；在生理条件下，负责TMEM16A激活的Ca²⁺信号似乎局限于特定的纳米结构域中。例如，在痛觉相关DRG神经元中，瞬时受体电压门控维拉诺伊?1（TRPV1）通道、肌醇三磷酸受体1（IP?R1）和TMEM16A聚集在膜–内质网纳米结构域中，这些结构域将局部Ca²⁺信号转化为神经元去极化[4]。在血管平滑肌细胞中，使TMEM16A通道激活的局部Ca²⁺信号传导微结构域包括G_qPCRs、IP₃Rs、电压激活的钙通道、TRPC6通道和瑞诺丁受体（RyR），而在内皮细胞中则发现了G_qPCRs和TRPV4通道[5]。由于其广泛的生理相关性[[6], [7], [8]]，通过TMEM16A的Cl^-流动参与血压调节、痛觉刺激的转导[[10], [11], [12]]以及激素分泌[13,14]。当该通道过度表达或发生突变时，会导致高血压[15,16]、癌症[17,18]和气管软化[19]等疾病。

TMEM16A的Ca²⁺依赖性功能已在细胞、分子和结构层面得到了广泛研究[6,20]。尽管有三个Ca²⁺结合位点似乎调节TMEM16A的Ca²⁺敏感性，但只有两个位点被结构和功能上确定了。通道孔道的开放发生在Ca²⁺与由第6、7和8螺旋残基形成的正构位点结合时[[21], [22], [23], [24]]。有趣的是，当Ca²⁺与由二聚体界面上的第2和10螺旋残基形成的位点结合时，它可以通过别构调节正构位点的Ca²⁺敏感性来控制TMEM16A[25]。Ca²⁺与正构位点的结合，加上别构位点的调节，会引发一系列结构重排，从而打开通道孔道并允许Cl?传导[21,26,27]。

相比之下，控制TMEM16A活性的细胞和分子机制了解较少。有证据表明，Ca²⁺/钙调蛋白依赖性的磷酸化/去磷酸化平衡对TMEM16A的活性至关重要[28]。例如，CaMKII介导的磷酸化会降低TMEM16A的活性，而钙调神经磷酸酶（CaN）等磷酸酶引起的去磷酸化则会增强其活性[[29], [30], [31], [32]]。因此，冠脉动脉中的Ca²⁺激活的Cl^-电流会因环孢素（CsA）等CaN抑制剂而减少，而在肺动脉中，持续活性的CaN则会增加Cl^-电流[33,34]。虽然此前认为预关联的apocalmodulin有助于TMEM16A的Ca²⁺依赖性，但钙调蛋白在TMEM16A激活中的作用仍存在争议[35,36]。无论如何，CaMKII和CaN的激活都需要Ca²⁺/钙调蛋白[37,38]。因此，细胞内Ca²⁺水平的升高可能会间接影响通道的磷酸化状态和功能。

我们之前的研究表明，当加入离子霉素使细胞内Ca²⁺水平升高时，TMEM16A会与CaN和FKBP12结合，CaN抑制剂CsA和FK506可以部分但不是完全地抑制TMEM16A的活性[39]。我们假设细胞内Ca²⁺水平的升高在生理条件下促进了TMEM16A-FKBP12-CaN异三聚体的形成，从而维持了TMEM16A的活性。然而，FK506也可能直接调节FKBP12的功能，就像在瑞诺丁受体Ca²⁺通道中所报道的那样[40]，或者通过一个独立于CaN的机制起作用，如在气道上皮中所报道的[41]。

在这项研究中，我们调查了FKBP12是否与TMEM16A相互作用，以实现依赖于CaN的通道调节。我们的结果证实了FKBP12与TMEM16A的C末端存在直接相互作用。重要的是，我们也在贴壁HEK293细胞的质膜胞质面上检测到了这种相互作用。此外，CsA和FK506在缺乏CaN的细胞中没有效果，表明它们的抑制作用依赖于CaN。另外，C末端截短的TMEM16A通道对FK506不敏感，这表明破坏FKBP12的结合可以阻止CaN被招募到质膜上，并消除依赖于CaN的TMEM16A调节。因此，我们的工作确定了介导TMEM16A与CaN–FKBP12复合物之间相互作用的特定结合位点，该复合物能够上调TMEM16A的Cl^-电流。

章节摘录

质粒、抗体和试剂

本研究中使用的材料列于表1中。一种编码针对人类钙调神经磷酸酶A（PPP3CA）的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒质粒，以及一种携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的 scramble shRNA对照质粒，均购自OriGene Technologies公司。编码小鼠TMEM16A（ac）变异体并融合3xFLAG标签的pEGFP-N1质粒，以及编码融合mCherry的TMEM16A的mCherry-TMEM16A-pN1质粒，由H. C. Hartzell博士提供。

TMEM16A和FKBP12在质膜上共定位并相互作用

TMEM16A介导的氯离子电流通过依赖于CaN的去磷酸化而增强。我们之前已经证明TMEM16A-FKBP12-CaN复合物的形成是这种调节所必需的，但控制TMEM16A与CaN-FKBP12复合物相互作用的分子机制尚不清楚[39]。由于我们之前的模型认为FKBP12同时与CaN和TMEM16A结合，因此我们专注于表征FKBP12与TMEM16A之间的相互作用。

讨论

Hawn及其同事回顾了研究表明，CaMKII介导的磷酸化会降低通过TMEM16A通道的氯离子电流。相反，PP1/PP2A磷酸酶的去磷酸化可以抵消磷酸化作用并帮助调节通道活性[51]。我们之前已经报道过，钙调神经磷酸酶（CaN）作为一种PP3磷酸酶，可以增强TMEM16A的活性。在这里，我们提供了证据表明小分子蛋白FKBP12直接与TMEM16A的C末端相互作用，可能起到

作者贡献

M. L. Guzmán-Hernández：生成CaN KD细胞，进行并分析了共免疫沉淀（Co-IP）和双荧光复合体（BiFC）实验、羧基末端刮取实验，并撰写和审阅了手稿。

Miriam Huerta：进行了共定位实验、基于膜的表达谱实验、羧基末端刮取实验、TMEM16A和TMEM16A-ΔCend双荧光复合体实验，并撰写和审阅了手稿。

Ana Elena López-Romero：进行了膜片钳实验，分析了数据，并审阅了手稿。

Rita Morán-Zendejas：进行了膜片钳实验。

数据可用性声明

所有实验数据均包含在结果部分。额外数据也作为补充数据提供。

CRediT作者贡献声明

María Luisa Guzmán-Hernández：撰写 – 审阅与编辑，编写初稿，验证，方法学研究，数据分析，概念化。Miriam Huerta：撰写 – 审阅与编辑，编写初稿，验证，方法学研究，数据分析，概念化。Ana Elena López-Romero：可视化处理，验证，数据分析，概念化。Rita Morán-Zendejas：可视化处理，验证，数据分析。

María Luisa Guzmán-Hernández|Miriam Huerta|Ana Elena López-Romero|Rita Morán-Zendejas|Abigail Betanzos|Patricia Pérez-Cornejo|Jorge Arreola