自动化化学发光法（CLIA）替代酶联免疫吸附试验（ELISA）用于QuantiFERON-TB Gold Plus检测：一项基于39,000例样本的真实世界比较研究

《Microbiology Spectrum》：Comparison of QuantiFERON-TB Gold Plus results using ELISA and automated CLIA detection: a 39,000-sample real-world study

目的：QuantiFERON-TB Gold Plus（QFT-Plus）是一种广泛用于诊断结核分枝杆菌感染的干扰素-γ释放试验（IGRA）。近期进展引入了全自动化学发光免疫分析（CLIA）平台作为传统酶联免疫吸附试验（ELISA）的替代方案，有望提升分析性能与实验室工作流程。本研究在常规临床实践中，比较了基于ELISA和CLIA（分别采用冻干与液体结合物）的QFT-Plus检测方法。方法：这项回顾性研究纳入了在三个不同的一年期（2019年采用ELISA、2023年采用冻干结合物的CLIA、2024年采用液体结合物的CLIA）内进行的39,604次QFT-Plus检测。结果分类为阳性、阴性或不确定。不确定结果进一步归因于低丝裂原反应（LMR）或高本底值（HNV）。结果：不确定结果的比例从ELISA组的6.5%（777/11,885）显著下降至冻干结合物CLIA组的3.1%（394/12,690）和液体结合物CLIA组的3.1%（470/15,029）（P < 0.0001）。阳性结果分别占各组检测数的10.6%（1,254/11,885）、10.3%（1,312/12,690）和9.0%（1,355/15,029）。在不确定结果中，ELISA组LMR占97.3%（756/777），而冻干与液体结合物CLIA法中HNV分别占27.4%（108/394）和16.8%（79/470）。所有方法中TB1与TB2应答的一致性均很高（98.5%–98.8%；κ = 0.92）。结论：基于CLIA的QFT-Plus检测在保持优异TB1/TB2一致性的同时，与ELISA相比显著降低了不确定结果的比例。这些发现支持全自动CLIA平台作为传统ELISA在高通量结核筛查和常规临床诊断中的稳健高效替代方案。

研究背景、现存问题与研究目的

结核病仍是全球重大公共卫生挑战，2024年估计有1070万新发病例和123万死亡病例。干扰素-γ释放试验（IGRA）在诊断结核分枝杆菌感染尤其是潜伏性结核感染（LTBI）中发挥关键作用。QuantiFERON-TB Gold Plus（QFT-Plus）是美国食品药品监督管理局批准的最新一代IGRA，其设计旨在同时刺激CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答，从而捕获更广泛的抗原特异性细胞免疫，以提高在近期暴露者、幼儿和免疫功能低下患者中的灵敏度。传统上，QFT-Plus依赖酶联免疫吸附试验（ELISA）技术定量干扰素-γ（IFN-γ），但ELISA仅为部分自动化，需手动操作、校准和训练有素的操作人员，限制了高通量实验室的工作效率。为解决这些局限，化学发光免疫分析（CLIA）被引入作为替代IFN-γ检测平台，可实现全自动化和缩短处理时间。其中，LIAISON XL分析仪上的QFT-Plus检测于2019年获FDA批准，最初采用需复溶的冻干结合物，2024年起改用即用型液体结合物以提高试剂一致性。此前研究人员在一项小样本头对头比较中发现，在检测线性范围内，CLIA比ELISA产生更高的定量IFN-γ值，导致更多确定结果和接近临界值样本转化为阳性边缘结果。本研究旨在通过三个独立一年期（2019年、2023年、2024年）的大规模真实世界数据，比较传统ELISA与采用冻干或液体结合物的LIAISON QFT-Plus CLIA平台的检测结果。为减少COVID-19大流行期间报告的不确定结果频率升高带来的潜在偏倚，2020–2022年数据被排除。

关键技术方法

本研究为回顾性观察研究，纳入2019年1月至12月、2023年1月至12月和2024年1月至12月三个预定研究期内所有作为常规诊断活动进行的QFT-Plus检测，且有有效最终分类的结果。血液样本采集至QFT-Plus采血管（本底管Nil、TB1、TB2和丝裂原管），在采血后16小时内于37℃孵育16–24小时，随后离心分离血浆进行IFN-γ定量。IFN-γ浓度测量依据研究时期采用两种分析平台：2019年使用SkyLab自动化系统（Dasit，意大利）进行ELISA检测；2023年和2024年使用LIAISON XL分析仪（DiaSorin，意大利）分别采用冻干结合物和液体结合物进行CLIA检测。所有操作均按制造商说明书执行。结果判读标准：阳性定义为TB1和/或TB2抗原反应减去本底管（Nil）值后≥0.35 IU IFN-γ/mL；阴性为低于此阈值；不确定结果分两类——低丝裂原反应（LMR）：丝裂原IFN-γ值<0.5 IU/mL；高本底值（HNV）：本底管IFN-γ值>8.0 IU/mL。本研究未收集临床数据，数据分析匿名进行，经伦理委员会批准。

研究结果

QFT-Plus检测在ELISA与CLIA平台上的分析性能

2019年ELISA分析11,885份样本：阴性9,854份（82.9%），阳性1,254份（10.6%），不确定777份（6.5%）。不确定结果中，LMR占756份（97.3%），HNV占21份（2.7%）。11,108份确定结果中TB1与TB2一致性为98.5%（κ=0.92）。阳性结果中1,088份（86.7%）TB1和TB2均阳性；TB1单独阳性样本中位IFN-γ值为TB1 0.46 IU/mL、TB2 0.24 IU/mL；TB2单独阳性样本中位IFN-γ值为TB1 0.24 IU/mL、TB2 0.45 IU/mL。

2023年冻干结合物CLIA分析12,690份样本：阴性10,984份（86.6%），阳性1,312份（10.3%），不确定394份（3.1%）。不确定结果中LMR 286份（72.6%），HNV 108份（27.4%）。12,296份确定结果中TB1/TB2一致性为98.6%（κ=0.92）。阳性结果中1,140份（86.9%）双管阳性；TB1单独阳性样本中位值TB1 0.45 IU/mL、TB2 0.22 IU/mL；TB2单独阳性样本中位值TB1 0.24 IU/mL、TB2 0.45 IU/mL。

2024年液体结合物CLIA分析15,029份样本：阴性13,204份（87.9%），阳性1,355份（9.0%），不确定470份（3.1%）。不确定结果中LMR 391份（83.2%），HNV 79份（16.8%）。14,559份确定结果中TB1/TB2一致性为98.8%（κ=0.92）。阳性结果中1,182份（87.2%）双管阳性；TB1单独阳性样本中位值TB1 0.45 IU/mL、TB2 0.24 IU/mL；TB2单独阳性样本中位值TB1 0.25 IU/mL、TB2 0.45 IU/mL。

不确定结果分析

三种分析方法间阴性、阳性和不确定结果的分布差异显著（P<0.0001），主要源于CLIA相比ELISA的不确定结果大幅减少。冻干结合物CLIA的不确定比例比ELISA低3.43个百分点（风险差RD -3.43%，95%置信区间CI -3.97至-2.90），液体结合物CLIA低3.41个百分点（RD -3.41%，95% CI -3.94至-2.89），而两种CLIA结合物间无显著差异。不确定原因分析显示，ELISA不确定结果几乎完全由LMR引起（97.3%），而CLIA检测中HNV占比显著更高（冻干结合物27.4%，液体结合物16.8%）。

讨论与结论总结

讨论部分指出，从ELISA向CLIA平台过渡使不确定结果比例从6.5%降至3.1%，降幅约50%。一个主要发现是不确定结果模式的改变：ELISA不确定结果绝大多数（97%）由LMR引起，而CLIA检测中HNV占比显著增高（17–27%），提示高背景IFN-γ水平可能部分受检测技术和试剂配方影响而非单纯反映生物学变异。研究人员引用此前对419份相同标本的头对头比较结果，在检测线性范围内CLIA产生系统性更高的定量IFN-γ值，尤其围绕固定决策阈值时差异明显。该配对研究中，因LMR而ELISA不确定但CLIA确定的标本，其中位数校正后的丝裂原值从0.34升至0.94 IU/mL；ELISA阴性/CLIA阳性标本的中位TB1和TB2值在ELISA下接近阳性阈值（分别为0.21和0.24 IU/mL），但在CLIA下更高（分别为0.49和0.51 IU/mL）。这为当前研究中观察到的不同不确定结果分布提供了合理的分析框架：由于LMR和HNV采用固定定量阈值定义（校正后丝裂原<0.5 IU/mL和本底值>8.0 IU/mL），不同平台间的定量信号分布差异可能改变落在阈值两侧的样本比例。因此，CLIA期间LMR频率降低和HNV相对频率升高不应被理解为诊断性能更优的证据，而可能部分反映了相对于固定决策阈值的定量信号测量差异。然而，本研究的一个局限性在于不同时期测试的样本并非来自配对人群，分析效应无法与测试人群特征（如人口学、检测指征、结核感染患病率、住院/门诊构成、免疫状态等）的潜在时间变化相区分。此外，阳性率从ELISA时期的10.6%降至液体结合物CLIA时期的9.0%，在没有临床和人口学数据的情况下，这一变化可能反映病例组合差异、分析效应或两者兼有。所有平台上TB1与TB2抗原管间一致性持续高度一致（κ=0.92），支持QFT-Plus双抗原设计的稳健性，表明方法差异主要影响定量信号强度而非抗原特异性免疫识别。CLIA平台还提供全自动化、减少手工操作、消除批处理和降低试剂消耗等操作优势。

研究结论：在这项大型回顾性研究中，CLIA时期进行的QFT-Plus检测相比ELISA时期具有更低的不确定结果比例，同时各方法间TB1/TB2一致性保持高水平。由于分析方法应用于不同日历时期和非配对人群，且缺乏独立参考标准或临床信息，这些发现不应被解释为诊断准确性更优的证据。需要进行前瞻性配对样本研究来确定观察到的差异在多大程度上反映平台的分析特性、结合物配方或测试人群的差异。