从韩国牲畜废水中分离的Brachymonas denitrificans KE5的完整基因组序列及生物降解潜力分析

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Brachymonas denitrificans KE5, an aromatic compound–degrading bacterium isolated from livestock wastewater

　　

摘要

我们报道了从牲畜废水中分离的Brachymonas denitrificans KE5的完整基因组序列。基因组分析揭示了参与芳香族化合物降解的基因，包括双加氧酶和儿茶酚降解途径，表明该菌在生物降解有机污染物方面具有潜在应用价值。

公告

Brachymonas denitrificans是一种革兰氏阴性、有氧细菌，属于金球杆菌科（Comamonadaceae）(1)。

我们报道了菌株B. denitrificans KE5的完整基因组序列，该菌株于2024年8月从韩国庆尚北道 Sangju的猪废水中分离获得。为富集目标微生物，将5克泥浆样品加入最小盐培养基（使用美国Sigma-Aldrich试剂自行配制，如先前所述[2]）中，于30°C、150 rpm条件下有氧培养14天。使用无菌0.85%（w/v）NaCl溶液进行十倍梯度稀释（10^?1至10^?10），涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA；美国BD Biosciences）平板上，在30°C条件下培养48小时。通过连续转接分离获得纯单菌落。

全基因组测序时，将KE5菌株在TSA平板上于30°C培养3天，随后使用Maxwell RSC组织DNA试剂盒（Promega，美国）按照制造商的规程提取基因组DNA，未作任何修改。使用g-TUBE（Covaris，美国）将DNA剪切后，利用SMRTbell Express试剂盒（PacBio）构建长读长文库。通过BluePippin系统（Sage Science，美国）进行大小筛选，去除15 kb以下的DNA片段。测序在PacBio Revio平台上进行，使用SMRT Link v25.1对原始读段进行接头修剪和质量过滤(3)。短读长测序文库使用TruSeq Nano DNA试剂盒（Illumina，美国）制备，在Illumina NovaSeq 6000平台上测序。使用Trimmomatic v0.38对原始短读段进行修剪(4)。使用Canu v2.2 (5)在SMRT Link v25.1 (3)中对长读段进行从头基因组组装。使用Illumina短读段通过Pilon v1.22进行两轮迭代精修(6)来优化组装结果，随后使用BWA-MEM v0.7.17进行覆盖度分析(7)。

测序共产生44,829条PacBio读段（N50为6,708 bp；总计273.2 Mb）和23,620,488条Illumina双端短读段（2 × 150 bp，总计3.6 Gb）。通过评估读段深度和复制子环化确认了组装质量，平均基因组覆盖度达到97.06×。基因组注释使用美国国家生物技术信息中心原核生物基因组注释流水线v6.11结合GeneMarkS-2+ (8)完成。除另有说明外，均使用默认参数。数字DNA-DNA杂交（dDDH）分析（GGDC 4.0 [9, 10]）显示与B. denitrificans模式基因组DSM 15123（GenBank登录号：GCA_900110225）的dDDH值为75.6%。完整染色体长度为2,814,929 bp，G + C含量为64.0%，包含2,664个基因（其中2,571个蛋白质编码基因）。BUSCO v5.1.3 (11)分析显示完整度为98.39%（重复率0.81%）。基于模式菌株基因组服务器的中点扎根系统发育基因组树(12, 13)表明，KE5菌株与模式菌株B. denitrificans DSM 15123聚集成簇(图1)。

图1

图1 使用模式菌株基因组服务器生成的KE5菌株及相关模式菌株的全基因组系统发育树。系统发育基因组树使用FastME 2.1.6.1 (12)基于通过d?公式计算的基因组BLAST距离系统发育（GBDP）距离推断得出。自举支持值（100次重复中>60%；总平均支持度为79.6%）标注在节点上方，树为中点扎根方式(13)。KE5菌株与Brachymonas denitrificans的基因组亲和性最高。叶片标签依次标注物种/亚种聚类归属、G + C含量（%）、Δ值、基因组大小（bp）和蛋白质总数（从左至右）。

KE5菌株拥有编码参与芳香环降解的推定蛋白的基因（catA、pcaH和pcaG）、脂肪族化合物降解（alkB）、脱卤（had）、重金属抗性（arsC、arsR和ctpA/copA）、毒性外排系统（mexD/cusA）和氧化解毒（CYP家族）的基因（表1），为除臭化合物的生物修复提供了潜在应用基础。

表1

表1 韩国牲畜废水中B. denitrificans KE5的组装统计数据和基因组特征

参数	B. denitrificans的结果
样品来源	牲畜废水
采样地点	韩国Sangju市猪废水处理厂
样品类型	粪便
分离年份	2022
读段数	PacBio（44,827），Illumina（23,620,488）
读段类型	双端测序
基因组长度（bp）	2,814,929
contigs数量	1
GC含量（%）	64.0
测序深度（×）	97.06
编码DNA序列	2,571
tRNA	54
ncRNA	3
rRNA	3、3、3（5S、16S、23S）
生物降解基因	10个（catA、pcaH、pcaG、alkB、had、arsC、arsR、ctpA/copA、mexD/cusA、CYP）
CRISPR阵列	3
登录号	JBYLRO010000000

致谢

本研究得到了韩国气候能源环境部资助的洛东江国家生物资源研究院（NNIBR）的资助（NNIBR20263109）。