《European Journal of Cell Biology》：Nischarin interaction with LGR4 mediates the suppression of the Wnt/β-catenin signaling pathway
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Nischarin与LGR4蛋白存在相互作用。Nischarin抑制Wnt信号通路。Nischarin抑制LGR4-RANK1-GSK3β信号通路。Nischarin调控神经突延伸。Nischarin是本实验室鉴定的一种强效乳腺肿瘤抑制因子，是整合素α5亚基（
Nischarin与LGR4蛋白存在相互作用。Nischarin抑制Wnt信号通路。Nischarin抑制LGR4-RANK1-GSK3β信号通路。Nischarin调控神经突延伸。Nischarin是本实验室鉴定的一种强效乳腺肿瘤抑制因子，是整合素α5亚基（integrin α5 subunit）的相互作用伙伴。NISCH基因定位于染色体3p21上的转移抑制基因座，该区域在乳腺癌及其他癌症中频繁缺失。除整合素α5外，Nischarin还通过与Rac1、Pak1、Rab14、STK11/LKB1、LIMK及AMPK的关联调控多条信号通路和病原体吞噬过程。Nischarin通过细胞骨架组织、外泌体分泌、细胞凋亡、乳腺发育、上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）、代谢及长链非编码RNA表达来调控细胞迁移。本研究发现Nischarin与LGR4相互作用并调节Wnt信号通路。在MDA-MB 231和HEK 293T细胞中，Nischarin的过表达显著抑制了Wnt信号通路中的关键蛋白。此外，PC12细胞对神经生长因子（nerve growth factor, NGF）表现出类神经突反应。敲低Nischarin导致PC12细胞中Wnt信号通路多个蛋白表达升高，并增强了Neuro 2a细胞的神经突长度。
论文解读
一、研究背景与科学问题
Nischarin是一种胞质支架蛋白，最早由Alahari实验室鉴定为整合素α5亚基的相互作用伙伴，并被证实为强效乳腺肿瘤抑制因子。NISCH基因定位于染色体3p21的转移抑制基因座，该区域在乳腺癌等多种癌症中频繁缺失，提示其在肿瘤抑制中的重要作用。过去二十年的研究揭示，Nischarin作为胞内衔接蛋白，通过与Rac1、Pak1、LIMK、LKB1、AMPK等多种激酶的相互作用，参与调控Rho-Ras-Pak信号转导、细胞迁移、细胞骨架组织、外泌体分泌、细胞凋亡、乳腺发育、上皮-间质转化（EMT）、代谢以及长链非编码RNA表达等多个生物学过程。
在神经科学领域，Nischarin在大鼠脑内广泛分布，尤其在大脑皮层和海马区高表达，提示其可能在神经功能中发挥关键作用。神经发生（neuritogenesis）——包括神经突的形成、延伸和分支——是神经系统发育的关键阶段。已有研究表明Nischarin通过调控p21活化激酶（PAK）活性抑制神经突生长，但其调控神经发生的具体分子机制尚不清楚。
LGR4（又称GPR48）是G蛋白偶联受体（GPCR）家族的成员，属于富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体（LGR）家族B组。LGR4的配体包括R-spondins（RSPO）、norrin、nidogen-2和RANKL。RSPO与LGR4及E3连接酶ZNRF3/RNF43形成细胞表面三元复合物，解除ZNRF3/RNF43对Wnt/β-catenin信号通路的抑制，从而增强通路激活。此外，LGR4与RANK竞争结合RANKL，当RANKL结合LGR4时，激活Gαq介导的糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号通路，从而抑制破骨细胞分化过程中的经典RANK信号。
尽管Nischarin和LGR4各自的功能已有较多研究，但二者之间是否存在直接相互作用、这种相互作用如何影响Wnt/β-catenin信号通路以及神经突延伸，此前尚无报道。本研究旨在阐明Nischarin与LGR4的相互作用及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控机制。
二、主要技术方法
研究人员综合运用了多种关键技术手段：通过免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光共定位实验验证蛋白相互作用；利用ClusPro 2.0服务器和MOE软件的蛋白质-蛋白质对接模块进行分子建模，预测Nischarin-LGR4复合物的结合界面；构建Nischarin过表达和敲低的稳定细胞系（包括MDA-MB 231、HEK 293T、MCF7、PC12和Neuro 2a细胞）；采用双荧光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin信号通路活性；通过蛋白质免疫印迹检测Wnt信号通路关键蛋白表达水平；利用视黄酸诱导Neuro 2a细胞分化并结合ImageJ软件测量神经突长度。细胞系均来自美国典型培养物保藏中心（ATCC），并经过STR基因分型鉴定和支原体污染检测。
三、研究结果
3.1 Nischarin与LGR4是结合伙伴
研究人员首先通过质谱分析鉴定出LGR4为与Nischarin共纯化的候选蛋白。随后在HEK293T细胞中共转染Myc-Nischarin和Flag-HA-LGR4，通过双向免疫共沉淀实验（Myc-IP和HA-IP）证实了Nischarin与LGR4之间存在特异性相互作用。免疫荧光双标染色进一步显示，Myc-Nischarin与FH-LGR4在HEK293T细胞中共定位，为二者的物理相互作用提供了细胞学证据。
3.2 分子建模
利用ClusPro 2.0服务器和MOE蛋白质-蛋白质对接模块，研究人员构建了Nischarin-LGR4复合物的推定结构模型。预测的结合界面显示，Nischarin的R248与LGR4的V799、Nischarin的H226与LGR4的K809、Nischarin的E196与LGR4的K809、Nischarin的N411与LGR4的T726、Nischarin的D439与LGR4的C761之间形成氢键或盐桥相互作用。两种对接方法预测的复合物结构具有相似性，为该相互作用提供了原子水平的结构依据。
3.3 Nischarin过表达抑制Wnt/β-catenin信号通路
研究人员建立了MCF7/LGR4稳定细胞系，发现Wnt/β-catenin信号通路蛋白如Axin1、β-catenin、cyclin D1等在该细胞系中表达上调，且细胞增殖和迁移能力增强，ALDH1蛋白和ABCG2、MMP-9基因表达显著上调。相反，在MDA-MB 231和HEK 293T细胞中过表达Nischarin后，Wnt信号通路的关键蛋白——包括cyclin D1、CDK4、Axin1、β-catenin、Dvl2和LRP6——均被显著抑制。此外，Nischarin过表达还导致GSK-3β、p-GSK-3β和p65（Rel-A）的表达下调，提示Nischarin可能参与LGR4-RANKL-GSK-3β信号通路的调控。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，Nischarin过表达可抑制Wnt3a或RSPO2诱导的Wnt/β-catenin信号通路活性。
3.4 Nischarin调控神经突延伸
研究人员利用shRNA在Neuro 2a细胞中建立了Nischarin敲低的稳定细胞系。结果显示，Nischarin敲低后，经视黄酸诱导分化的Neuro 2a细胞神经突长度显著增加。在PC12细胞中，Nischarin敲低导致Wnt信号通路多个蛋白（包括β-catenin、cyclin D1和Dvl2）表达上调，进一步支持Nischarin通过抑制Wnt信号通路调控神经突延伸的结论。
四、讨论与结论
本研究首次揭示了Nischarin作为LGR4的结合伙伴，能够抑制Wnt3a或RSPO2激活的LGR4/Wnt信号通路，并可能拮抗LGR4介导的NFκB信号。分子对接模型从原子水平预测了二者的结合界面，为理解该相互作用的分子基础提供了结构见解。在神经发生方面，Nischarin与LGR4的相互作用如何影响生理条件下的神经突生成仍需进一步研究，Nischarin敲除与LGR4转基因小鼠的脑组织切片研究可能有助于阐明这一问题。此外，鉴于LGR4和Nischarin在心血管疾病中均发挥重要作用，Nischarin-LGR4相互作用可能为动脉粥样硬化的发展提供新的解释。该研究为理解Nischarin调控Wnt/β-catenin信号通路的分子机制提供了重要基础，也为相关疾病的治疗开发提供了潜在靶点。
