《Food Chemistry》：Measuring wine tannin through pigment subtraction by spectrophotometer
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摘要红葡萄酒是一种含有数千种化合物的复杂混合物。花青素和原花青素（PAs）是红葡萄酒品质最重要的贡献者之一，影响着颜色、涩感和长期颜色稳定性。在酿酒和陈酿过程中，PAs 会发生结构修饰，产生葡萄酒单宁（WTs）和色素单宁（PTs）。我们证明，在 280 nm 处，Malvid
摘要
红葡萄酒是一种含有数千种化合物的复杂混合物。花青素和原花青素（PAs）是红葡萄酒品质最重要的贡献者之一，影响着颜色、涩感和长期颜色稳定性。在酿酒和陈酿过程中，PAs 会发生结构修饰，产生葡萄酒单宁（WTs）和色素单宁（PTs）。我们证明，在 280 nm 处，Malvidin-3-O-葡萄糖苷的摩尔吸光系数（ε）是（?）-表儿茶素的 4.6 倍。通过操纵布格 - 比尔 - 朗伯定律并修正测量的 280 nm 吸光度中色素的贡献，解释了 WTs 和 PTs 的 ε 差异。该修正应用于 24 种跨越不同色素水平范围的商业红葡萄酒。高色素葡萄酒比低色素葡萄酒表现出更大的光谱干扰，导致定量修正分别高达 19% 和低达 1.7%。该方法改进了 WTs 和 PTs 的定量分析，并推进了我们对红葡萄酒稳定颜色形成的理解。
引言
过去 50 年间，酚类化合物的定量方法发生了巨大变化。能够分离酚类化合物类别，而不是仅获得总酚含量测量值，极大地提高了科学界对这些化合物特定类别进行详细研究的能力。早期关于一类被称为 PAs 的聚合物类黄酮的历史研究，因其与蛋白质的相互作用而被评估。后来从溶液中分离这些化合物的分析工作利用了它们与蛋白质结合的能力，使其从溶液中沉淀出来。这是使用源自牛或马骨头或蹄子的明胶进行的。(Rossi Jr & Singleton, 1966) 20 世纪 70 年代，使用 Sephadex LH-20 从溶液中分离出 PAs，使其得以分离并随后探测结构特征。(Thompson et al., 1972) 此外，PAs 沉淀开始使用标准化材料，如牛血清白蛋白（BSA）和甲基纤维素，从溶液中沉淀 PAs，从而以更具体的方式量化其浓度。(Hagerman & Butler, 1978; Harbertson et al., 2003; Mercurio et al., 2007; Sarneckis et al., 2006). 20 世纪 80 年代固相萃取（SPE）柱的出现，利用小型 C18 柱实现了多酚类物质的分级分离。(Oszmianski et al., 1988) 这些技术在分析 PAs 方面都有一个共同主题——利用其固有的疏水和氢键相互作用，使用蛋白质或类似替代品将其分离。
固相萃取柱可能会面临单体酚类物质从聚合物材料中回收率或分离效果差的问题，导致干扰。一种较新的 SPE 技术使用 HLB（Hydrophilic-Lipophilic Balanced，亲水 - 亲脂平衡）柱，而不是 C18 柱，将 PAs 与其他类黄酮分离。PAs 物质紧紧结合在该固相上，需要使用纯甲酸作为溶剂才能完全洗脱 PAs 物质，而单体酚类物质则完全通过酸化水乙腈去除。该方法在快速分离 PAs 方面显示出显著的前景，回收率很高（88–95%）。(Jeffery et al., 2008).
由于 PAs 的高回收率，以及与其他类黄酮类别（特别是黄酮醇、单体花青素和吡喃花青素，它们可能会干扰 280 nm 吸光度）的分离，HLB 固相提供了一条清晰的路径，用于直接分析植物提取物、食品和饮料中 PAs 的浓度。然而，在更复杂的溶液（如红葡萄酒）中，这些聚合物中 PAs 亚基之间的共价键可能在陈酿过程中断裂，允许亲电中间体与其他亲核试剂（包括花青素等类黄酮）发生反应，最终产生赋予葡萄酒持久红色的色素。这种断裂及随后的反应导致 280 nm 吸光度的一部分归因于花青素，而非纯粹的黄烷 -3-醇亚基。如果这些化合物的摩尔吸光率存在差异，这可能导致干扰，从而造成定量误差。鉴于（?）-表儿茶素经常被用作 WTs 定量的标准，这一点尤为重要。
决定是否从定量中去除花青素，是关于红葡萄酒中什么构成“原花青素”的一种哲学讨论。一旦花青素被掺入聚合物中，它们现在是否被视为 WTs 的一部分？如果我们能够从 WTs 的总体计算中去除以黄烊盐形式存在的比例，我们应该这样做吗？
如果论点认为是花青素在 PAs 定量中起到了干扰作用，那么它们本身就不能是 PAs。这一定义由 Edwin Haslam 发表，指出“可溶性聚合物原花青素完全由黄烷 -3-醇单元组成”。(Haslam, 1998) 因此，掺入原花青素中的花青素应被视为干扰。由于葡萄酒中 PAs 的复杂性，可能更合适地使用更模糊的术语来称呼它们，例如“葡萄酒单宁”。Hoffman 等人表明，通过分离和断裂，这些聚合物在本质上可以非常复杂。(Wollmann & Hofmann, 2013).
然而，另一方面，即使认为花青素的掺入是一种干扰，红葡萄酒酚类化合物界也对其在发酵和陈酿过程中掺入这些植物聚合物的有色物质进行更好的定量分析很感兴趣。然而，目前的技术要么是通过高效液相色谱（HPLC），要么是通过亚硫酸氢盐漂白。(Harbertson et al., 2003; Peng et al., 2002; Watrelot, 2021) 目前的 PT HPLC 方法在将大分子量 WTs 与低分子量（LMW）材料分离方面做得很好，但在处理较小的低聚物材料时却力不从心。此外，亚硫酸氢盐漂白用于 PT 定量可能会受到影响，因为其中一些掺入的色素可被漂白，而其他非聚合物化合物（如吡喃花青素）不会被亚硫酸氢盐漂白。(Salas, Atanasova, et al., 2004) 因此，该技术可能更适合定量 4-碳位置修饰的花青素（吡喃花青素），而不是 PTs。此外，所有色谱方法都比比色分析方法复杂得多，且耗时更多。
为了尝试更准确地定量 WTs 和 PTs——测试了一种简单的方法，利用花青素的双重吸光度（280 和 535 nm），使其能够从 WTs 定量中减去。这提供了一种快速方法，仅使用紫外 / 可见分光光度计即可准确定量 WTs 和 PTs。
我们相信，该方法结合了之前讨论的从 WTs 中减去色素相关吸收的方法，以及一种非常有效的 WTs 分离方法，可能对未来试图了解 PTs 和 WTs 对红葡萄酒品质影响的研究者有用。(Jeffery et al., 2008; Salas et al., 2005).
章节片段
Malvidin-3-O-葡萄糖苷和（?）-表儿茶素的摩尔吸光系数（ε）
配制了一种浓度为 810 mg/L 的 Malvidin-3-O-葡萄糖苷（M3G）分析标准品（Sigma Aldrich，MO，美国）储备溶液，溶剂为含有 0.1 N HCl 的甲醇。使用储备溶液的稀释液（30、25、20、15、10 和 5 mg/L）绘制了标准曲线。溶液的摩尔浓度是通过从分子量中减去 Cl?（假设 M3G 与 Cl 的浓度等摩尔）后计算得出的（计算 1)）。然后通过绘制吸光度与
摩尔吸光系数
Malvidin-3-O-葡萄糖苷（M3G）的摩尔吸光系数（ε）在酸化水、乙醇和甲醇中（取决于溶剂）520 至 540 nm 处已有广泛报道。(Asenstorfer, 2001) 然而，在掺入花青素的 WTs 分析中，如果 280 nm 处的吸收与（?）-表儿茶素不相似，可能会造成干扰。为了探索 M3G 是否具有与（?）-表儿茶素（通常用作 PAs 分析的标准）相似的吸光率，配制了 810 mg/L 的储备溶液
结论
尽管酚类化合物界已知使用 EC 作为 WTs 定量的统一标准会导致固有的不准确，这是由于亚基之间 ε 的差异所致，但这里清楚地表明 PTs 会加剧这种情况，特别是在深红色葡萄酒中。
尽管不同品种的黄烷 -3-醇亚基比例存在差异，但花青素的含量也有显著差异。鉴于不同品种之间花青素含量的巨大差异，该方法
CRediT 作者贡献声明
James R. Campbell: 写作 – 审阅与编辑、写作 – 原稿、验证、方法论、调查、形式分析、概念化。Elisabeth J. Forrestel: 写作 – 审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能被认为会影响本文报告的工作。
致谢
我们要感谢 Andrew L. Waterhouse、Encarna Gómez-Plaza 和 James A. Kennedy 在实验和本手稿写作期间的讨论和协助。
James R. Campbell|Elisabeth J. Forrestel
