温度对基于噬菌体的生鸡肉非伤寒沙门氏菌控制效果的影响

《Food Microbiology》：Effect of temperature on bacteriophage-based control of non-typhoidal Salmonella on raw chicken meat

　　

家禽常与非伤寒沙门氏菌（non-typhoidal Salmonella，NTS）引起的食源性疾病相关，因此需要额外的抗菌干预措施。噬菌体（bacteriophages，phages）可作为食品中的生物防控剂（biocontrol agents），但现有产品面向一般应用设计，未考虑温度和pH对感染动力学变化的影响。噬菌体的高宿主特异性为针对特定应用定制处理方案提供了机会。本研究旨在开发并评估一种在禽类生产条件下控制NTS的噬菌体组合。五株噬菌体在4°C、14°C、22°C和41°C（pH 5.9）下24 h内的稳定性未受影响（p < 0.05）。在22°C和41°C（pH 5.9）下评估了产毒性宿主范围（productive host range）、裂解时间（burst time）和噬菌体滴度变化。温度影响了SE11、SE20和SF5的产毒性宿主范围。与22°C相比，41°C下裂解时间普遍缩短，而对噬菌体滴度的影响则因噬菌体而异。使用三株噬菌体组合（SE4、SE13、SE20）在胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）中评估其对肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis，SE）的抑制效果（感染复数；multiplicity of infection，MOI 1-1000）。MOI 1000在22°C下延迟SE生长7.0 ± 0.5 h，在41°C下延迟2.6 ± 0.1 h。在模拟禽类胴体冷却过程中，噬菌体组合处理（MOI 10⁴）在0、8、16、72和96 h时显著降低了生鸡胸肉上的SE水平（p < 0.05），最大减少量为2.40 ± 0.52 log（16 h），并在48、96和120 h时将SE降至检测限以下。总体而言，噬菌体产品的定制化在禽类生产条件下的生物防控应用中显示出前景。

**论文解读：温度调控噬菌体防控生鸡肉非伤寒沙门氏菌的感染动力学与定制化策略**

**一、研究背景与问题**

非伤寒沙门氏菌（non-typhoidal Salmonella，NTS）是全球食源性疾病的主要致病菌之一，世界卫生组织将其列为四种主要腹泻病原体之一。在加拿大，生禽产品中沙门氏菌污染率超过15.4%即触发工艺改进要求，而不列颠哥伦比亚省在相关监测项目实施前的数据显示，23%的生鸡胸肉样本可检出沙门氏菌，表明现有控制措施仍有提升空间。噬菌体（bacteriophages，phages）作为特异性感染细菌的病毒，已被证实可在多种食品基质中减少NTS，且具有清洁标签、有机、不影响食品感官品质等优势。然而，现有商业噬菌体制剂通常面向多种食品和宽泛的加工条件设计，未充分考虑温度和pH对噬菌体感染动力学参数（如裂解时间、裂解量）的影响。此外，常用的点斑法（spotting assay）测定的宿主范围可能反映的是裂解但不伴随子代噬菌体释放的“非产毒性”相互作用，而非实际增殖能力。因此，本研究旨在禽类生产相关条件下，通过一步生长曲线法评估噬菌体的产毒性宿主范围和感染动力学，进而设计和优化针对禽类相关NTS的定制化噬菌体组合。

**二、研究目的与实验设计**

研究人员提出假设：温度会影响噬菌体性能，与22°C相比，41°C下噬菌体的裂解时间更短和/或裂解量更大。为此，研究分为三个阶段：首先，评估五株先前分离的噬菌体（SE4、SE11、SE13、SE20、SF5）在4、14、22和41°C（pH 5.9）条件下的环境稳定性；其次，通过一步生长曲线法测定每株噬菌体对七株禽类相关NTS分离株的产毒性宿主范围及感染动力学参数（裂解时间、噬菌体滴度变化Δ）；最后，基于互补的宿主范围和感染动力学特征，筛选三株噬菌体（SE4、SE13、SE20）组成噬菌体组合，分别在营养肉汤和生鸡肉表面评估其对三株肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis，SE）混合物的抑制效果，其中生鸡肉实验模拟了加拿大禽类胴体冷却工艺（41°C 2 h→14°C 2 h→6°C 2 h→4°C至120 h）。

**三、主要关键技术方法**

研究采用了以下关键技术：环境稳定性测定（将噬菌体稀释于pH 5.9的TSB中，于不同温度下储存，通过软琼脂覆盖法测定滴度）；一步生长曲线法（在MOI 0.01下吸附5 min，去除未吸附噬菌体后每隔10 min取样计数，以确定产毒性宿主范围和裂解时间）；微量肉汤稀释法结合酶标仪动态监测OD₆₀₀（评估不同MOI下噬菌体组合对SE生长的抑制并计算曲线下面积AUC）；人工污染生鸡肉模拟冷却实验（将SE混合物接种于25 g鸡胸肉样本，喷洒噬菌体组合后按CFIA规定的冷却程序处理，在多个时间点进行选择性平板计数和增菌检测）。样本来源方面，细菌菌株分离自不列颠哥伦比亚省农业部（BCMOA）的家禽诊断和环境样本，生鸡肉购自温哥华当地超市，噬菌体分离自BC省环境样本。

**四、研究结果**

**4.1 环境稳定性** 五株噬菌体在4、14、22°C下48 h内滴度均无显著变化；在41°C下，仅SE4在8 h至48 h间出现显著下降，但降幅小于0.5 log PFU/mL，考虑到禽类胴体在2 h内需冷却至14°C的生产要求，该下降不具有实际影响，因此所有噬菌体均被认为在测试条件下具有可接受的稳定性。

**4.2 温度对产毒性宿主范围的影响** 一步生长曲线结果显示，温度对SE11和SE20的产毒性宿主范围有影响：SE11在41°C时仅对S7具有产毒性裂解能力而22°C下无，SE20在22°C时可裂解6/7株宿主而在41°C时减少至4/7。SE4、SE13和SF5的产毒性宿主范围在两种温度下保持一致。SE20和SE13表现出最宽的产毒性宿主范围，而SE4、SE11和SF5仅能裂解至多一株宿主。值得注意的是，先前基于点斑法在37°C下测定的宿主范围与本研究观察到的产毒性宿主范围并不一致，例如SF5在点斑法中可完全裂解S1、S2、S3和S5，但在一步生长曲线中未观察到裂解，提示存在裂解但不产毒（如外部裂解或流产感染）的机制。

**4.3 温度对感染动力学的影响** 对10个在两种温度下均有产毒性裂解的噬菌体-宿主组合进行分析，所有组合的裂解时间在41°C下均较22°C缩短，缩短幅度为10至50 min不等。Δ噬菌体滴度的变化则呈现噬菌体特异性：SE20倾向于在22°C下具有更大Δ滴度，SE13则在41°C下Δ滴度更大，而部分组合不受温度影响。

**4.4 噬菌体组合在TSB中对SE的抑制效果** 在22°C和41°C下，MOI 1000均最有效地延长SE生长的延迟期，分别延迟7.0 ± 0.5 h和2.6 ± 0.1 h。AUC分析显示，22°C下所有MOI（1-1000）均显著降低AUC；41°C下仅MOI 1000和100显著降低AUC，MOI 10和1与阳性对照无显著差异。所有处理组SE最终均恢复指数生长，提示存在噬菌体抗性菌株的出现。

**4.5 噬菌体组合在生鸡胸肉上对SE的抑制效果** 在模拟胴体冷却过程中，噬菌体处理组在0 h即表现出SE浓度显著低于阳性对照（减少1.50 ± 0.09 log CFU/mL），表明抗菌作用迅速起效。处理组在16 h时SE浓度显著降低（2.30 ± 0.35 log CFU/mL），最大减少量为16 h时的2.40 ± 0.52 log CFU/mL；在48、96和120 h时SE浓度低于检测限（2 log CFU/mL）。对照组的SE在120 h内持续可检出。选择性增菌实验表明，三个生物学重复中有一个重复在96 h和120 h后未检出活菌，说明噬菌体处理联合温度降低可在部分样本中完全消除SE。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，噬菌体的产毒性宿主范围和感染动力学均受温度影响，但影响方式因噬菌体而异，这强调了在接近实际应用条件下评估噬菌体的必要性。斑点法测定的宿主范围可能高估噬菌体的实际应用潜力，而一步生长曲线法能更准确地反映噬菌体在目标环境中的增殖能力。本研究中，SE20在22°C下表现更优，SE13在41°C下表现更优，这为根据应用场景选择合适的噬菌体组合提供了依据。与现有商业产品相比，本研究中的噬菌体组合在模拟冷却条件下于16 h内实现了2.40 log的减少，优于SalmoFresh?在4°C储存7天达到的1.1-log最大减少，尽管研究条件存在差异。研究结论表明，温度在噬菌体感染动力学中发挥重要作用，从而影响噬菌体处理的整体效果；虽然噬菌体处理不能完全消除SE，但作为禽类生产中与其他策略并用的干预措施具有实用价值。未来工作应探索该噬菌体组合与常用化学抗菌剂的兼容性和协同效应，并评估在禽类生产链其他环节（如屠宰前）的应用潜力。