使用无提取数字PCR快速定量鸡胸肉中的沙门氏菌

《Food Microbiology》：Rapid quantification of Salmonella in chicken breast using extraction-free digital PCR

沙门氏菌定量检测仍是家禽常规监测中的一个关键空白，因为大多数监管和行业工作流程仍依赖仅能反映“有/无”的检测结果，而无法体现污染负荷。本研究开发并评估了一种基于invA基因靶标、无需提取的数字PCR（dPCR）工作流程，用于在短富集后快速定量鸡胸肉中的沙门氏菌。研究选取了代表鼠伤寒血清型、肠炎血清型和I,4,[5],12:i:-血清组的6株沙门氏菌，经冷应激处理后，以0.1、1和10 CFU/g的目标浓度接种至鸡胸肉中，随后在改良缓冲蛋白胨水（mBPW）中进行6小时富集。富集后的细菌细胞经浓缩后，未进行DNA提取直接用于dPCR。定量性能以参考最可能数法（MPN，从同一批接种样品中进行）以及bioMérieux GENE-UP和Hygiena BAX SalQuant平台（平行接种样品）为基准进行比对。方法输出值经过log₁₀转换，并使用Bland-Altman分析评估其与测量接种量之间的一致性。无需提取的dPCR在整个测试范围内能够密切追踪接种量水平，与接种量相比，其平均偏差最低（0.195 log₁₀单位），优于MPN、GENE-UP和BAX。MPN显示出适度的正偏差（平均偏差 = 0.354 log₁₀单位），与基于稀释的计数变异性一致，而GENE-UP和BAX的估计值变异性较大，且表现出系统性正偏差（平均偏差分别为1.160 log₁₀单位和2.390 log₁₀单位）。总体而言，无需提取的dPCR工作流程提供了一种简化的方法，用于在富含抑制物的鸡胸肉基质中定量沙门氏菌水平，减少了耗时DNA提取的依赖性，同时支持超越“有/无”检测的风险知情监测。沙门氏菌仍然是美国食源性疾病的主要致病原因。尽管进行了广泛的控制努力，多年来沙门氏菌检测呈阳性的食品样本数量仍居高不下，然而人类感染率的降低进度却慢于预期（WHO, 2016）。认识到这一重大的食品安全挑战，美国卫生与公众服务部（HHS）与农业部（USDA）及其他合作伙伴协调，设定了"健康人民2030"国家目标，以纯培养菌株来自佛罗里达大学食品微生物学实验室菌种保藏中心（美国佛罗里达州塔拉哈西）、美国肉类动物研究中心Roman L. Hruska（美国内布拉斯加州克莱中心）和美国国家家禽研究中心（美国佐治亚州雅典）的菌种保藏中心。利用代表100个血清型的111株沙门氏菌肠亚种评估了该方法的包容性，并使用涵盖革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的22株非靶标菌株评估了其特异性无需提取的dPCR工作流程对所有受试沙门氏菌菌株均具有包容性，并且与所有非靶标菌株无交叉反应。所有在10^-4稀释度下检测的沙门氏菌菌株均为阳性，而在10^-2稀释度下检测的所有非靶标菌株均为阴性（附表1和2）。使用标准平板计数法确认了鸡胸肉中实际达到的沙门氏菌接种量水平。在所有受试菌株中，测量的平均log₁₀（CFU/g）沙门氏菌检测对于维护家禽产品的安全性至关重要，然而常规工作流程通常仅能提供"有/无"检测结果。这限制了检测结果在数据驱动的风险评估中的使用程度，因为污染水平在决定公共卫生影响和干预紧迫性方面起着重要作用（NACMCF, 2024）。因此，业界对能够提供污染水平估计的快速定量方法兴趣日益增加，以支持总之，本研究表明，基于dPCR的沙门氏菌定量方法在富含抑制物的鸡胸肉基质中具有实际操作可行性，且未降低检测方法的定量能力。通过去除耗时的DNA提取这一限速步骤，该工作流程为常规沙门氏菌监测和合规检测提供了一种切实可行的方法，创造了超越二元"检出/未检出"结果、转向污染水平信息的机遇，从而更好地Nethraja Kandula：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，可视化，方法学，调查，形式化分析，概念设计。Victoria Cortes：撰写——审阅与编辑，方法学，调查，形式化分析。Prashant Singh：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，监督，资源，项目管理，资金获取，数据整理，概念设计。Lin Walker：撰写——审阅与编辑，资源。Hannah Brown：撰写——审阅与编辑bioMérieux, ; bioMérieux, 2025; Ferguson and Ihrie, v1.7.0; USDA, 2022.作者声明，他们没有已知可能影响本论文所报道工作的相互竞争的经济利益或个人关系。本研究由USPOULTRY研究资助资助，资助编号为746。USDA是平等机会的提供者和雇主。名称用于如实报告可获得的数据；然而，USDA既不保证也不承诺产品的质量，且USDA使用这些名称并不意味着在排除其他可能同样适用的产品的前提下批准该产品。Nethraja Kandula|Victoria Cortes|Hannah Brown|Lin Walker|Charlene R. Jackson|Joseph M. Bosilevac|Prashant Singh佛罗里达大学健康、营养与食品科学系，佛罗里达州塔拉哈西，邮编32306