基于生物正交点击化学的唾液酸转移酶高通量活性检测方法

《Biology Methods and Protocols》：An Integrated Workflow for Real-Time Chemoenzymatic CMP-Sialic Acid Preparation and a Bioorthogonal Microplate Sialyltransferase Assay (MPSA)

　　

摘要

唾液酸化在细胞表面糖蛋白和糖脂的末端发挥关键作用，对调控细胞间相互作用、人体健康状态以及病理过程至关重要。这一关键修饰由二十种具有不同特征的人类唾液酸转移酶所介导，这些酶具有精细的底物特异性和立体化学性质，使其成为高度优先的治疗靶点。因此，可靠的唾液酸转移酶活性检测和定量技术对于转化研究和抑制剂筛选至关重要。为满足这一需求，我们提出了一种详细的化学-酶法合成方案，用于制备一种C5炔基功能化的CMP-Sia供体底物，专为生物正交点击化学设计。该合成方案与开发一种简单、高灵敏且可重复的微孔板检测方法相结合，用于对各个唾液酸转移酶的活性进行深入酶学表征。该方案通过简化底物制备流程并优化微孔板检测指标，消除了常见的通量限制。我们的结果表明，该检测方法在多种唾液酸转移酶亚型之间均表现出优异的灵敏度和一致性。最终，这一统一方法建立了目前可用于唾液酸转移酶谱分析和小分子抑制剂筛选的最稳健、易重复且高通量的平台之一。