LGALS3BP与神经母细胞瘤细胞外囊泡中选择性货物富集的关联研究

《Frontiers in Oncology》：LGALS3BP is associated with selective cargo enrichment in neuroblastoma extracellular vesicles

　　

目的：LGALS3BP（亦称Galectin-3结合蛋白、Gal-3BP或90 K）是一种参与肿瘤进展的多功能分泌性糖蛋白，已成为包括神经母细胞瘤（NB）在内的多种恶性肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点。越来越多的证据表明，LGALS3BP有助于塑造NB肿瘤微环境（TME），尤其是通过其在肿瘤来源细胞外囊泡（EVs）上的富集，这可能调控肿瘤-基质相互作用。研究人员研究了LGALS3BP是否在NB中参与基质细胞调节，并与EV货物组成的变化相关联。 方法：研究人员使用了一株天然缺失LGALS3BP的患者来源NB细胞系（hNB CTRL）及其异位重新表达LGALS3BP的配对细胞系（hNB LGALS3BP）。将骨髓来源间充质干细胞（BMMSCs）暴露于NB来源的条件培养基（CM），以评估受体细胞中的细胞因子分泌和LGALS3BP检测。通过微小RNA（miRNA）和蛋白质组学分析EV货物。通过qPCR和免疫印迹法对NB来源EVs中的候选分子进行验证。 结果：含有LGALS3BP的CM与BMMSCs分泌谱的改变相关，而肿瘤来源的胞外LGALS3BP在BMMSCs中被检测到。七个miRNAs在LGALS3BP-EVs中富集并在供体细胞中减少；其中四个在EV暴露后的BMMSCs中增加。蛋白质组学分析揭示了RNA结合蛋白（包括SRSF1）在LGALS3BP-EVs中的富集。 结论：LGALS3BP与EV货物组成的改变及BMMSCs分泌反应的变化相关，可能促进NB TME内的肿瘤-基质通讯。

研究背景与科学问题

神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿科癌症相关死亡的显著比例。高危NB的特征在于其侵袭性转移行为以及高度免疫抑制且浸润不良的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），常被描述为免疫学“冷”肿瘤，这限制了现有免疫治疗策略的效果。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为肿瘤-宿主相互作用的关键介质，能够调节周围基质细胞和免疫细胞的行为。在NB中，肿瘤来源的EVs通过重塑TME为促肿瘤生态位，积极参与促进肿瘤生长和转移扩散。LGALS3BP（又称Galectin-3结合蛋白、Gal-3BP或90 K）因其在免疫调节、细胞粘附和肿瘤进展中的多功能作用而备受关注。该蛋白是一种分泌型、高度糖基化的蛋白，在包括NB在内的多种癌症中频繁过表达。已有研究表明，LGALS3BP在癌症来源的EVs表面高度富集，且EV相关LGALS3BP水平升高与临床前NB模型中转移潜能的增加相关。此外，靶向分泌型LGALS3BP的抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）不仅能增强淋巴细胞浸润至肿瘤微环境，还能在同基因临床前NB模型中与抗PD-1疗法协同作用，改善肿瘤控制。

近年来，大量研究强调了EVs递送肿瘤特异性货物（包括致癌蛋白和miRNAs）以重编程TME中受体细胞的能力，通常促进免疫抑制和肿瘤进展。值得注意的是，LGALS3BP的存在对于含有免疫抑制性miRNAs的EVs的有效内化是必要的。此外，NB来源的EVs能够以LGALS3BP依赖的方式诱导间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）分泌促肿瘤细胞因子如IL-6，突显了其在塑造基质景观中的作用。

为进一步探究分泌型LGALS3BP的潜在贡献，研究人员将LGALS3BP异位重新引入一株天然缺失该蛋白表达的患者来源NB细胞系（hNB）中，并以骨髓来源间充质干细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs）作为NB TME的代表性模型。通过对表达或缺失LGALS3BP的hNB细胞来源的EVs进行整合的miRNA谱分析和蛋白质组学分析，旨在鉴定与LGALS3BP相关的选择性富集的EV货物，并探讨其对基质细胞调节的潜在意义。

主要技术方法

研究人员采用患者来源的NB细胞系（hNB），该细胞系天然完全缺失LGALS3BP表达。通过慢病毒介导的稳定转导，建立了异位重新表达LGALS3BP的hNB细胞系（hNB LGALS3BP）及其对照细胞系（hNB CTRL）。利用差速超速离心法从细胞培养上清中分离EVs。通过TaqMan Array Human MicroRNA A Cards进行miRNA表达谱筛选，并使用SYBR Green茎环RT-PCR对筛选出的候选miRNAs进行验证。同时，采用液相色谱-串联质谱法（nanoLC-MS/MS）对细胞裂解液和EVs进行蛋白质组学分析。此外，通过多重Luminex分析和酶联免疫吸附试验评估BMMSCs的分泌谱变化，并通过共聚焦显微镜观察标记EVs与BMMSCs的相互作用。生物信息学分析利用了公开的NB数据集（GSE121513、GSE16444、Kocak、SEQC）。

研究结果

LGALS3BP诱导促肿瘤因子的分泌并与BMMSCs相关联： 通过将BMMSCs暴露于来自hNB CTRL或hNB LGALS3BP细胞的条件培养基（Conditioned Media, CM），多重Luminex分析显示，暴露于含LGALS3BP的CM后，BMMSCs的分泌谱发生广泛改变，表现为炎症性基质活化相关因子（IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、TNFα）、髓系相关因子（M-CSF、IL-10、IL-23）和血管生成介质（VEGF-A）等分泌增加。ELISA验证进一步证实了VEGF和IL-6分泌的增加。重要的是，在暴露于LGALS3BP阳性CM或纯化EVs的BMMSCs裂解液中检测到了高糖基化形式的LGALS3BP（约100 kDa），并且这种信号可被抗LGALS3BP治疗性抗体1959显著减弱。

NB LGALS3BP-EVs显示特定miRNAs的选择性富集及受体BMMSCs中miRNA丰度的增加： 探索性miRNA阵列筛选发现，与CTRL-EVs相比，LGALS3BP-EVs中有33个miRNAs差异表达，且以上调为主；而在亲代细胞中，有29个miRNAs差异表达，以下调为主。从中鉴定出7个在LGALS3BP-EVs中上调且在LGALS3BP表达细胞中下调的miRNAs（miR-26a-5p、miR-27b-3p、miR-29a-3p、miR-103a-3p、miR-152-3p、miR-340-5p、miR-374b-5p），提示它们被优先分选进入LGALS3BP-EVs。将BMMSCs暴露于这些EVs后，发现其中4个miRNAs（miR-340-5p、miR-27b-3p、miR-103a-3p、miR-152-3p）在受体细胞中丰度增加。对公共NB数据集的生物信息学分析显示，miR-27b和miR-340在NB肿瘤中相较于正常组织显著上调。

NB LGALS3BP-EVs显示特定RNA结合蛋白的富集，包括致癌剪接因子SRSF1： 探索性蛋白质组学分析揭示，LGALS3BP-EVs中多个RNA结合蛋白丰度增加，其中包括丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子（Serine/Arginine-rich Splicing Factor, SRSF）家族的成员。通过免疫印迹实验验证了SRSF1在LGALS3BP-EVs中的丰度增加，而其细胞内总水平无差异。值得注意的是，EV相关的SRSF1表现出与细胞内形式不同的表观分子量。对公开患者数据集的分析表明，SRSF1在高危NB患者中表达显著更高，且高SRSF1表达与较差的总生存期显著相关。

讨论与结论

本研究发现，LGALS3BP的表达与NB来源EVs的货物组成变化相关联。含LGALS3BP的CM能够改变BMMSCs的分泌谱，使其呈现更具促肿瘤性的特征，且肿瘤来源的胞外LGALS3BP可与BMMSCs发生关联。更重要的是，研究首次揭示了LGALS3BP与EVs中特定miRNAs和RNA结合蛋白（如SRSF1）的选择性富集有关。这些发现扩展了对LGALS3BP在NB中作用的认识，将其与EV介导的肿瘤-基质通讯联系起来。尽管本研究具有探索性质且存在局限性（如单次实验、需体内验证等），但这些结果为理解LGALS3BP如何通过调控EV货物来影响TME提供了新的视角，并支持其作为潜在治疗靶点和生物标志物的进一步研究价值。

研究结论翻译： 总之，本研究拓展了当前对LGALS3BP作为NB TME中肿瘤-基质串扰新兴参与者的理解，识别出LGALS3BP与EV货物组成变化之间先前未被认识的关联。与既往观察一致，本研究结果进一步支持LGALS3BP表达与基质分泌反应之间的关联，同时揭示了NB来源EVs中调节性miRNAs和RNA结合蛋白的选择性富集。尽管是探索性的，这些发现为LGALS3BP在NB肿瘤-基质通讯中的潜在贡献提供了新见解，并支持其作为潜在治疗靶点和生物标志物的进一步研究。