小关节标志引导下有限骨切除的小鼠多节段DRG注射：L3-L6靶向病毒递送与功能验证

《Frontiers in Neurology》：A facet joint landmark-guided approach for multi-segmental DRG injection with limited bone removal in mice

　　

背景：靶向基因递送至背根神经节（DRG）已被开发为疼痛研究的一种有价值方法。然而，常规DRG显微注射方法存在显著缺陷：椎骨切除和小关节（facet joint）破坏诱导脊柱不稳定，广泛组织粘连阻碍重复手术，多节段靶向仍然具有挑战性。方法：为建立多节段DRG注射工作流程，研究人员基于小鼠解剖分离开发了一种椎骨计数方案。为指导病毒递送目标节段的选择，使用Thy1-YFP-H转基因小鼠以良好分辨率示踪节段性DRG支配模式。随后进行解剖分离以检查每个目标DRG与其邻近小关节之间的精确空间关系。借助该解剖路线图以及定制设计的临时脊柱稳定器，研究人员建立了适用于用户指定节段的标准化注射流程。术后，对动物行为进行系列评估，最后进行体内GCaMP钙成像以验证功能性病毒转导。结果：基于棘突上V形白线的椎骨计数能够可靠识别腰椎节段。YFP示踪阐明了不同的节段性支配模式：L₁-L₂纤维不参与坐骨神经；L₃-L₅共同形成坐骨神经；L₆纤维加上少量L₅分支构成阴部神经。额外的解剖分离证实，在头侧椎骨下关节突基底部钻孔提供了到达L₃-L₆ DRG的直接通路。注射后的系列行为监测显示短暂功能紊乱，其中大多数在术后第21天恢复。最后，同步jGCaMP8s成像证实了成功功能性转导：气流刺激在转导的DRG神经元中诱发强烈钙反应，而在野生型对照中未检测到此类信号。结论：研究人员已建立了一种可重复的病毒递送方法，该方法通过椎板钻孔最小化骨切除并避免严重小关节破坏，同时能够对小鼠L₃-L₆ DRG进行多节段注射。纵向行为监测和刺激诱发钙成像的结合支持了该方法的手术可行性和功能性转导。因此，该方法提供了一个实验工具包，应可用于通过多节段DRG基因操作解析躯体-内脏疼痛交叉对话。

背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）包含初级传入神经元胞体，将外周躯体和内脏伤害性信号传递至中枢神经系统。通过病毒载体对DRG进行基因操作已成为解析疼痛通路、光遗传/化学遗传操作和临床前慢性疼痛基因治疗的核心技术。小鼠L₃-L₆腰椎DRG参与后肢躯体感觉、神经病理性疼痛模型和腹盆腔内脏伤害性研究。现有DRG递送策略各有局限：鞘内病毒输注对DRG选择性差；外周神经注射依赖逆行轴突运输，纤维群转导不一致且偏好运动神经元；全身AAV给药需高滴度且个体差异大。DRG显微注射可实现细胞类型特异和节段限制表达，但传统入路常需较大椎板切除或小关节（facet joint）切除，导致脊柱不稳定、术后组织粘连、重复手术困难，且呼吸心跳导致DRG位移，多节段靶向困难。此外，小鼠腰骶骨骼变异和节段支配描述差异促使研究人员开展内部解剖验证。因此，研究人员建立一种以小关节为骨标志、有限骨切除、可多节段注射的小鼠DRG病毒递送流程，结论是该流程可重复，最小化骨切除，避免严重小关节破坏，覆盖L₃-L₆，并通过纵向行为监测和刺激诱发钙成像支持手术可行性和功能转导；其意义在于为多节段DRG基因操作、躯体-内脏疼痛交叉对话研究提供实验工具包。

关键技术方法概括：研究人员基于小鼠解剖分离建立棘突V形白线椎骨计数；使用Thy1-YFP-H、Cx3cr1-GFP、Thy1-GCaMP6s转基因小鼠及C57BL/6J小鼠进行解剖映射、标志验证和钙成像。C57BL/6J小鼠来自Charles River (China)，转基因小鼠来自The Jackson Laboratory。关键技术包括小关节下关节突基底部定位微钻孔、定制临时脊柱稳定器固定、重组腺相关病毒（rAAV）载体rAAV9-hSyn-jGCaMP8s显微注射、系列体重/Von Frey/rotarod/open field行为评估，以及POD 21气流刺激诱发体内钙成像。

研究结果：椎骨标志识别：通过野生型C57BL/6J和三种转基因小鼠解剖，棘突V形白线可宏观识别，最尾侧V形线对应L₆棘突，放置不可吸收缝线标记；从L₆向头侧计数，并用T₁₃肋骨计数验证，微CT重建显示白线标志与深部骨结构对应。腰椎DRG支配映射：通过Thy1-YFP-H小鼠YFP轴突示踪和额外小鼠解剖验证，L₁-L₂不参与坐骨神经，L₁-L₂和部分L₃纤维形成闭孔神经和股神经；L₃-L₅纤维束形成坐骨神经；L₆不参与坐骨神经，而与少量L₅分支形成阴部神经。小关节标志-DRG空间对应：通过Cx3cr1-GFP等标本和微CT确认DRG不位于小关节正下方，而位于更头侧；钻孔坐标位于头侧椎骨下关节突基底部，垂直轨迹可到达下方DRG，同时保留小关节；在多种基因型共20只小鼠中，标志引导钻孔可靠暴露目标DRG。手术流程：麻醉、脱毛、中线切口、L₆缝线标记、双侧椎旁肌分离、定制脊柱稳定器固定、小关节标志下0.5 mm微钻钻孔、rAAV9-hSyn-jGCaMP8s与Fast Green共注射，每个DRG 200 nL、40 nL/min、留置5 min；术后闭合和护理，POD 21宏观评估脊髓和DRG表面光滑无粘连，椎板完整。终末体内钙成像（POD 21）：在48只病毒注射、3只sham、3只na?ve小鼠中成像，共432个DRG，180个病毒注射DRG均检测到刺激诱发钙瞬变；麻醉无刺激时自发活动少，气流刺激后转导DRG出现强钙反应，野生型对照无。体重显示组别和时间依赖性恢复轨迹：10组基线体重无显著差异；所有手术组POD 3-7体重下降，双侧多节段组恢复延迟，POD 21多数恢复至基线或以上。双侧注射诱导可逆的节段-剂量机械痛敏：单侧注射未产生对侧镜像痛；双侧注射产生节段数量相关的可逆机械痛敏，双侧L₄单节段无显著下降，双侧L₄-L₅、L₃-L₅、L₃-L₆依次更明显且持续，POD 21部分残余但明显减弱；因无载体对照和组织学，不能确定残余归因于病毒转导还是持续手术创伤。短暂运动损害后出现稳健Rotarod学习效应：POD 3所有手术组短暂运动缺陷，POD 5起改善，POD 14组间差异消失，无持续运动缺陷。短暂运动抑制并在POD 21功能恢复：开放场中POD 3-5运动速度下降，双侧多节段后肢恢复慢；POD 21所有组恢复基线运动指标，无永久运动功能障碍。

讨论总结：讨论指出，该方法利用小关节骨标志限制骨钻孔，实现L₃-L₆多靶点注射；V形白线从尾到头计数和L₆永久标记提供可重复术中参考，T₁₃肋骨计数金标准验证。腰椎过渡椎变异不影响功能节段支配，因此计数策略具功能相关性。YFP示踪显示L₃-L₅坐骨神经和L₆阴部/盆腔内脏传入，支持完整覆盖L₃-L₆以研究多节段汇聚和体-内脏感觉交互。该方法不能区分感觉与运动纤维，需进一步顺逆行示踪。钻孔保留小关节，降低医源性不稳定，但未减少软组织切开；POD 21无粘连支持安全。静态荧光不足以确认jGCaMP8s转导，刺激诱发钙成像重要；与GCaMP6s差异可能涉及麻醉深度、探针动力学和显微镜灵敏度。术后恢复低发病率。与Yuan et al.和O’Donnell et al.方案相比，本研究加入稳定器，一步覆盖L₃-L₆，保留骨结构和小关节；但未进行直接并行体内基准。局限包括随访仅21天、仅C57BL/6J、未测试疼痛模型、未系统分析AAV血清型转导效率和剂量神经毒性、安全性依赖行为和宏观解剖、宽场钙成像无单神经元分辨、缺乏节段免疫组化和病毒泄漏/脱靶评估。

研究结论部分翻译：总之，研究人员提出了一种手术方案，利用关节突骨标志，通过局部骨切除实现小鼠多个DRG节段的同步和聚焦靶向。该流程完全覆盖L₃-L₆节段，从而允许对两种不同初级感觉环路进行机制研究。该方法可在大多数目标节段产生一致结果，骨损伤极小，并产生大多为短暂性的术后功能缺陷，在多数动物中恢复。重要的是，一部分双侧L₃-L₆多节段注射小鼠在POD 21保留残余痛觉过敏，需要术前筛选。定制脊柱稳定器提供术中固定，方案允许在L₃-L₆内灵活选择目标节段。鉴于这些注意事项，该平台为研究多节段躯体感觉和内脏感觉输入整合以及DRG靶向基因治疗在慢性疼痛疾病中的临床前和转化应用提供了实用工具。