血清神经元来源细胞外囊泡（NDEVs）线粒体DNA（mtDNA）作为阿尔茨海默病（AD）所致轻度认知障碍（MCI）的早期诊断生物标志物及其多标志物联合诊断价值

《Frontiers in Aging Neuroscience》：Serum neuron-derived extracellular vesicle mitochondrial DNA as a potential biomarker for mild cognitive impairment due to AD

　　

背景：轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）最初的临床表现，最终演变为AD的典型特征，因此其早期识别至关重要。值得注意的是，线粒体功能障碍是AD的早期特征。神经元来源细胞外囊泡（neuron-derived extracellular vesicles, NDEVs）能够跨越血脑屏障，其线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）可反映脑内病变，具有较大潜力。在本研究中，研究人员检测了血清NDEVs中mtDNA的变化，并评价其作为AD所致MCI早期诊断生物标志物的潜力。方法：共纳入42例MCI患者、49例AD患者和57例年龄匹配的认知未受损（cognitively unimpaired, CU）对照。研究人员富集并表征血清NDEVs，采用qPCR定量其mtDNA水平。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析诊断性能，并探索多模态生物标志物的整合。结果：AD-MCI患者血清NDEVs mtDNA水平降低，MCI患者血清NDEVs mtDNA水平与简易精神状态检查（Mini-Mental State Examination, MMSE）评分呈显著正相关（r = 0.4864，P = 0.0407），AD组亦观察到类似关联（r = 0.3857，P = 0.0469）。在诊断性能方面，血清NDEV mtDNA在区分CU对照与AD受试者方面表现出色，曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.965（95% CI：0.933–0.997），敏感性为97.92%，特异性为89.09%。此外，其在区分早期MCI与AD方面也表现出中等效能（AUC = 0.736，95% CI：0.629–0.842；敏感性 = 72.92%，特异性 = 66.67%）。在临床和代谢因素的探索性分析中，MCI患者血清NDEV mtDNA水平与同型半胱氨酸（homocysteine, HCY）呈正相关；在AD患者中，合并糖尿病者NDEV mtDNA水平升高，并与甘油三酯（triglyceride, TG）呈正相关。值得注意的是，将NDEV mtDNA与已有生物标志物包括p-Tau₂₁₇、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和APOE ε4携带状态整合后，显著提高了MCI检测的准确性，突显其在多模态生物标志物策略中的价值。结论：MCI和AD患者血清NDEVs mtDNA水平显著降低，提示其作为AD所致MCI早期诊断生物标志物具有较强潜力。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的病理特征为淀粉样β蛋白（amyloid-β, Aβ）斑块进行性积聚和过度磷酸化tau蛋白聚集，这些神经病理改变常早于临床发病数十年。然而，现有诊断方法仍有限，即使结合临床评估、计算机断层扫描（computed tomography, CT）和认知评估，普通医师诊断准确性仅61%，痴呆专科医师也仅73%。轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）是AD最初的临床表现，最终可演变为AD的典型特征，即AD所致MCI，因此是早期检测、诊断和预防AD的关键窗口。一旦进展为全面痴呆，现有治疗疗效明显受限。纵向队列研究提示，28%的AD-MCI进展为AD痴呆，45%保持临床稳定，15%认知恢复正常，这凸显了改进生物标志物以实现早期检测和及时干预的迫切需求。近年来，AD诊断范式从纯临床评估转向生物标志物策略，血液标志物因微创和大规模筛查可行性受到关注。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），尤其神经元来源细胞外囊泡（neuron-derived extracellular vesicles, NDEVs），因可跨越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）并携带蛋白质、脂质、DNA、miRNA等生物分子参与细胞间通讯而备受关注。NDEVs的神经元特异性可减少非神经元囊泡干扰，提高病理相关性。线粒体功能障碍是AD早期特征，mtDNA拷贝数变化和突变是潜在标志物；AD患者脑组织和外周血中mtDNA水平降低，孟德尔随机化分析提示mtDNA对痴呆风险有因果贡献。但脑组织直接评估困难，脑脊液采集有创，因此需要可反映中枢病变的外周策略。基于此，研究人员开展本研究，检测AD及其前驱期MCI患者血清NDEVs mtDNA水平，并与核心AD标志物比较，评估其早期诊断价值及多标志物整合价值。研究结论提示，血清NDEVs mtDNA在MCI和AD患者中显著降低，具有作为AD所致MCI非侵入性早期生物标志物的潜力，且与p-Tau₂₁₇、GFAP和APOE ε4整合后可提高鉴别诊断能力。

在关键技术方法方面，研究于福建医科大学附属第一医院2022年2月至2024年10月招募参与者，最终纳入148例，包括42例MCI、49例AD和57例年龄匹配CU对照。诊断依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默病协会（National Institute on Aging and Alzheimer’s Association, NIA-AA 2011）标准，并结合脑MRI和/或PET-Aβ和/或PET-tau成像。采集空腹血清后，用商业试剂盒富集总EVs，并以L1CAM生物素化抗体免疫捕获NDEVs；采用纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）和蛋白免疫印迹验证NDEVs。经DNase I预处理后提取mtDNA，采用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）定量；以单分子免疫检测血清Aβ₄₀、Aβ₄₂、p-Tau₁₈₁、p-Tau₂₁₇、GFAP；通过APOE基因分型判断ε4携带状态；统计采用ROC曲线、逻辑回归和Bootstrap内部验证等。

研究结果如下。参与者特征及NDEV验证与表征：共148例受试者，三组年龄和性别分布无显著差异；AD组MMSE和MoCA评分显著低于MCI组；MCI组较CU组总胆固醇、TG、低密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖和尿酸升高，高密度脂蛋白胆固醇降低；AD组TG和葡萄糖高于CU组。NTA显示富集颗粒浓度为5.51 × 10¹⁰ ± 6.03 × 10⁹ particles/mL，模式直径132.0 ± 3.5 nm；蛋白免疫印迹检测到NDEV标志物L1CAM、CD63、TSG101，未检测到非外泌体标志物Calnexin；TEM显示圆形或杯状、磷脂双层、低电子密度囊泡样结构，提示NDEVs成功富集。血清NDEV mtDNA水平在AD和MCI中逐步下降：qPCR显示血清NDEVs mtDNA水平随痴呆严重程度增加而下降，MCI和AD组均显著低于CU组（均P < 0.0001），AD组又显著低于MCI组（P = 0.0298）。血清NDEVs mtDNA对MCI和AD的诊断及鉴别诊断效能：ROC分析显示，区分CU与MCI的AUC为0.875（95% CI 0.804–0.946），敏感性79.49%，特异性83.33%；区分MCI与AD的AUC为0.736（95% CI 0.629–0.842），敏感性72.92%，特异性66.67%；区分CU与AD的AUC为0.965（95% CI 0.933–0.997），敏感性97.92%，特异性89.09%。MCI与AD血清核心AD生物标志物比较：Aβ₄₀、Aβ₄₂及Aβ₄₂/Aβ₄₀比值在两组间无显著差异；AD组血清p-Tau₂₁₇、p-Tau₁₈₁和GFAP显著高于MCI组，p-Tau₂₁₇均值分别为10.34 ± 7.38 pg/mL与6.17 ± 4.08 pg/mL，p-Tau₁₈₁为7.62 ± 4.80 pg/mL与5.77 ± 3.37 pg/mL，GFAP为19.39 ± 9.39 pg/mL与14.48 ± 7.40 pg/mL（均P < 0.05）。血清NDEV mtDNA与核心AD生物标志物对MCI和AD诊断效能比较：NDEV mtDNA区分MCI与AD的AUC为0.736，优于Aβ₄₂（0.557）、Aβ₄₀（0.608）、Aβ₄₂/Aβ₄₀（0.561）、p-Tau₁₈₁（0.610）、p-Tau₂₁₇（0.667）和GFAP（0.663），提示其可能作为AD所致MCI较可靠的早期诊断标志物。血清NDEV mtDNA与临床特征及核心AD生物标志物相关性：MCI组血清NDEV mtDNA与MMSE评分正相关（r = 0.4864，P = 0.0407），与MoCA无显著相关；AD组与MMSE正相关（r = 0.3857，P = 0.0469），与MoCA正相关但未达显著（r = 0.4193，P = 0.1356）；两组中NDEV mtDNA与Aβ₄₀、Aβ₄₂、Aβ₄₂/Aβ₄₀、p-Tau₁₈₁、p-Tau₂₁₇、GFAP均无显著相关。探索性分析显示，MCI患者NDEV mtDNA与HCY正相关（r = 0.6972，P = 0.0027）；AD患者中糖尿病者NDEV mtDNA较高（P = 0.0012），并与TG正相关（r = 0.7070，P = 0.0002），与HCY无相关。纳入血清NDEV mtDNA的多生物标志物模型对AD-MCI诊断性能改善：NDEV mtDNA分别与Aβ₄₀、p-Tau₂₁₇、GFAP或APOE ε4联合后，AUC分别为0.752、0.762、0.783和0.773；三联模型中mtDNA + GFAP + APOE ε4的AUC为0.811，敏感性60.0%，特异性94.4%；四联模型mtDNA + p-Tau₂₁₇ + GFAP + APOE ε4的AUC为0.823，敏感性71.4%，特异性80.6%，Bootstrap校正后AUC为0.809（95% BCa CI 0.683–0.899），乐观偏倚0.014；扩展到五个或六个标志物未进一步提高AUC超过0.823，但敏感性升至82.9%或82.4%，特异性降至72.2%。四联模型在敏感性和特异性之间达到较优平衡，且诊断效能显著优于单独mtDNA标志物（P < 0.001）。

讨论部分认为，AD是连续病理谱，早期神经元损伤先于临床症状，因此需要可早期检测和纵向监测的新型标志物。本研究系统检测血清NDEVs mtDNA，发现其随认知损害严重度下降，并在区分MCI与AD方面优于血清Aβ₄₀、Aβ₄₂、Aβ₄₂/Aβ₄₀、p-Tau₁₈₁、p-Tau₂₁₇和GFAP；多标志物模型整合NDEV mtDNA、GFAP、p-Tau₂₁₇和APOE ε4后，可增强MCI向AD转化的预测能力，提供外周血候选靶标。文献提示mtDNA拷贝数降低与MCI向AD进展风险相关。脑组织匀浆研究通常报道AD皮质mtDNA减少7%至14%，额叶皮质可达50%，而海马和小脑改变轻微或不显著，存在区域特异性；外周血mtDNA在AD中也降低并与疾病严重度负相关，但研究间存在不一致。NDEVs可跨血脑屏障并特异性指示中枢神经系统线粒体损伤，其mtDNA降低可能直接反映受累脑区神经元mtDNA拷贝数减少。讨论还指出，血清GFAP单独区分AD与MCI的AUC为0.663；血清p-Tau₂₁₇在本队列中区分AD与MCI的AUC为0.667，诊断效用有限，与部分既往报告一致；而NDEV mtDNA表现出更优鉴别能力和高敏感性。APOE ε4是散发性AD最强遗传风险因素，与AD易感脑区线粒体功能障碍相关，可早于Aβ斑块、tau病理或认知下降。多标志物模型整合线粒体损伤、tau过度磷酸化、星形胶质活化和遗传易感性，符合多病理通路协同进展；补充Aβ₄₀和Aβ₄₂未带来增量诊断改善，可能因Aβ病理与APOE ε4状态及p-Tau₂₁₇释放相关，且MCI向AD转化中外周Aβ水平可能平台化或代偿性下降。NDEV mtDNA与MMSE正相关，但与Aβ或tau相关标志物无关联，提示其可能提供经典Aβ/tau标志物未捕获的信息，但不能确定其独立于Aβ-tau级联；仍需未来纵向和机制研究确定其主动贡献、下游后果或平行过程。研究还发现MCI阶段NDEV mtDNA与HCY正相关，提示高HCY可能促进早期AD线粒体损伤；AD阶段NDEV mtDNA与糖尿病状态和TG水平相关，提示高HCY、糖尿病和血脂异常等代谢风险因素可能通过调节神经元线粒体功能参与AD进展。作者认为，这是首次研究AD连续谱中血清NDEVs mtDNA改变，并证明其与p-Tau₂₁₇、GFAP和APOE ε4联合具有附加诊断价值。局限性包括部分亚组样本量较小，横断面设计无法区分稳定MCI与进展性MCI向AD转化，缺乏纵向随访数据，且脑脊液和PET数据仅见于小部分患者，无法与金标准直接比较。未来需更大规模前瞻性队列、纵向血清NDEV mtDNA测量和全面血液指标验证。研究结论翻译：本研究中，研究人员首次证明，血清NDEVs中mtDNA水平在AD-MCI患者和AD痴呆患者中显著降低，提示其作为AD所致MCI非侵入性早期生物标志物的潜力。值得注意的是，将血清NDEV mtDNA与p-Tau₂₁₇、GFAP和APOE ε4整合的多生物标志物模型显著提高了对AD所致MCI的鉴别诊断能力，在敏感性和特异性之间取得良好平衡。