亲和选择质谱（AS-MS）技术鉴定佩氏马钱（Strychnos peckii B.L. Rob）中乙酰胆碱酯酶配体

《Frontiers in Natural Products》：Affinity selection mass spectrometry (AS-MS) for identification of acetylcholinesterase ligands in Strychnos peckii B.L. Rob

　　

： 引言： 马钱属（Strychnos L.）物种在世界范围内被传统使用，并已知能够生物合成多种结构多样的生物碱。其中若干化合物已被报道可与中枢神经系统靶标相互作用，包括乙酰胆碱酯酶（AChE）。鉴于其在麻痹性制剂中的应用，研究人员采用亲和选择质谱（AS-MS）技术，将酶固定于磁性颗粒上，对佩氏马钱（S. peckii）水提物中的乙酰胆碱酯酶配体进行了筛选研究。 方法： 在AS-MS分析中，研究人员通过戊二醛作为连接臂，采用席夫碱化学法将200 μg电鳗乙酰胆碱酯酶（eelAChE）固定于10 mg氨基功能化磁珠上。对照样品在相同条件下制备，并使用100%甲醇（60 min）使酶失活。酶活性通过胆碱生成量进行监测。以加兰他敏（galantamine）作为参考配体，对四个阶段（孵育、磁分离、配体解离和LC-HRMS鉴定）的工作流程进行了优化，并确定了1.2的亲和比（AR）截止值。解离后的配体通过LC-HRMS分析，并使用MZmine软件进行离子对齐、解卷积和峰面积计算。 结果与讨论： 将AR > 1.2的代谢物归类为AChE配体，并基于MS/MS碎片数据、分子网络（molecular network）解析、in silico工具以及生物合成途径分析指导下的人工校正进行注释。所鉴定的配体包括：lyaloside（1）（AR，3.73）、10-羟基盖斯西唑（10-hydroxygeissoschizol）（2）（AR，3.69）、生物碱A（3）（AR，2.51）、5-羧基斯特里托西丁（5-carboxystrictosidine）（4）（AR，2.05）、corynantheol（5）（AR，2.04）、dolichantoside/isodolichantoside（6）（AR，1.90）、生物碱B（7）（AR，1.68）、斯特里托西丁（strictosidine）（8）（AR，1.66）、corynantheidal（9）（AR，1.63）、desoxycordifoline（10）（AR，1.57）、山柰酚-3-O-鼠李糖苷（kaempferol-3-O-rhamnoside）（11）（AR，1.36）、山柰酚（kaempferol）（12）（AR，1.35）、生物碱C（13）（AR，1.29）以及哈尔满-3-羧酸（harman-3-carboxylic acid）（14）（AR，1.27）。 结论： 总体而言，所鉴定的配体富集于单萜吲哚生物碱（monoterpene indole alkaloids，MIAs）及相关骨架，表明AS-MS是一种快速、无标记的策略，可从复杂的天然基质中优先筛选酶结合代谢物，并扩展佩氏马钱（S. peckii）中与AChE相互作用的化学空间。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

天然产物因其生物合成途径所产生的代谢多样性和立体化学复杂性，构成了结构多样性最丰富的小分子生物活性来源之一。这种多样性使其能够与多种生物靶标（包括蛋白质、肽、酶、受体和核酸）相互作用，使天然产物库在配体发现策略和药物开发中具有重要价值。然而，粗提物固有的复杂性带来了巨大的分析挑战，需要能够选择性分离、检测和注释生物活性成分的现代方法学。

亲和选择（affinity selection，AS）方法已被广泛开发以应对这些挑战，允许直接从合成混合物和天然混合物中鉴定配体。其中，亲和选择偶联高分辨率质谱（AS-MS）作为一种强大的无标记平台而备受关注，与高度复杂的基质兼容。通过避免分子标记的需要，AS-MS减少了与比色法或荧光测定相关的假象，并保留了天然的相互作用特征。典型的AS工作流程包括将混合物与生物靶标孵育、分离结合与未结合物种、解离配体-靶标复合物，以及对释放的配体进行高分辨质谱分析。严格的对照实验（通常使用变性或失活蛋白）对于校正非特异性相互作用和确保可靠的亲和力评估至关重要。

乙酰胆碱酯酶（AChE）在神经传递中通过调节乙酰胆碱水平发挥核心作用，其抑制仍是神经退行性疾病管理中的有效策略。因此，从复杂天然基质中鉴定AChE配体代表了亲和筛选方法的一个相关且具有挑战性的目标。

马钱属（Strychnos）以产生多种结构多样的吲哚和喹啉生物碱而闻名，这些生物碱来源于混合的莽草酸-乙酸生物合成途径。斯特里托西丁（strictosidine）等中心中间体产生多种生物碱亚类，其中许多表现出显著的生物活性，特别是在与神经传递相关的系统中。该属的若干成员已与能够调节胆碱能途径的化合物相关联。经典民族药理学研究自1548年以来就报道了亚马逊西北部生物群落中马钱属物种的使用情况。在此背景下，鉴于佩氏马钱（Strychnos peckii B.L. Rob）的化学复杂性和含有结构多样的具有相关生物活性的生物碱的可能性，研究人员针对乙酰胆碱酯酶对其进行了筛选。

二、研究目的与意义

本研究旨在应用一种使用固定在氨基功能化磁性颗粒上的AChE的AS-MS平台，从佩氏马钱（S. peckii）水提物中鉴定AChE配体。将亲和选择与LC-HRMS和去重复化（dereplication）相结合，提供了已知和先前未报道的AChE配体的鉴定，扩展了该物种的化学和生化理解，并证明了AS-MS在具有重要经典民族药理学研究的复杂天然产物基质中配体发现的有效性。

三、主要关键技术方法

研究人员采用亲和选择质谱（AS-MS）技术平台，将电鳗乙酰胆碱酯酶（eelAChE）通过戊二醛席夫碱化学法固定于氨基功能化磁珠上，并以100%甲醇处理制备失活酶对照。实验以加兰他敏为参考配体进行测定调节，建立了亲和比（AR）截止值1.2。解离后的配体通过液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析，数据经MZmine软件进行解卷积处理。配体注释结合了分子网络（molecular network，MN）分析、in silico去重复化工具（SIRIUS）以及生物合成途径分析指导的人工校正。部分代谢物通过正交色谱方法并与已发表的光谱数据比对，建立了最高置信水平的鉴定。植物样本采集自巴西马瑙斯Adolpho Ducke森林保护区（SisGen注册号AF4CFA7）。

四、研究结果

4.1 AS-MS分析与配体鉴定

亲和选择实验（n=3，活性酶）以三重复进行，对照实验（n=2，失活酶）以二重复进行。通过计算活性生物反应器（AChE-MB）与失活对照生物反应器（AChE-CMB）解吸液（S3）中平均色谱峰面积的比值获得亲和比（AR）。测定调节以加兰他敏为标准配体建立了1.2的AR截止值，共鉴定出14个AR值超过截止阈值的离子和2个接近阈值的离子。

4.2 分子网络分析与结构注释

分子网络（MN）分析将检测到的离子组织为三个主要分子家族。最丰富的家族（Cluster A）包含18个离子，包括配体1、4、8和10，其MS/MS谱图相似性表明属于同一结构类别。Cluster B包含配体5、9、2和16，Cluster C包含3和7以及另外11个离子。离子13以2.016 Da的质量差作为单节点连接，接近两个氢原子的中性质量，表明相关结构之间存在一个不饱和度差异。

4.3 配体结构鉴定

通过GNPS平台和SIRIUS软件进行in silico去重复化，Cluster A中的配体被注释为lyaloside（[M+H]⁺ m/z 527.2043）、5-羧基斯特里托西丁（[M+H]⁺ m/z 575.2258）、dolichantoside/isodolichantoside（[M+H]⁺ m/z 545.2520）、斯特里托西丁（[M+H]⁺ m/z 531.2358）和desoxycordifoline（[M+H]⁺ m/z 571.1947），质量误差均低于4 ppm。配体2、5、9和16分别被注释为10-羟基盖斯西唑（[M+H]⁺ m/z 313.1921）、corynantheol（[M+H]⁺ m/z 297.1973）、corynantheidal（[M+H]⁺ m/z 297.1971）和阿吗碱（ajmalicine）（[M+H]⁺ m/z 353.1874），质量误差低于3 ppm。配体14被注释为哈尔满-3-羧酸，质量误差为2.20 ppm。配体11、12和15分别被注释为黄酮类化合物山柰酚-3-O-鼠李糖苷（[M+H]⁺ m/z 433.1147）、山柰酚（[M+H]⁺ m/z 287.0560）和酚类化合物绿原酸（[M+H]⁺ m/z 355.1036）。Cluster C中的配体无法通过GNPS注释，in silico去重复化提示为结合吲哚和喹啉核心的生物碱，仅能提出分子式。

4.4 置信水平确认

代谢物4、8、10和11通过正交色谱方法进行了化学表征。这些代谢物先前已被分离，其光谱数据已发表。通过保留时间和MS²谱图比较，5-羧基斯特里托西丁、斯特里托西丁、desoxycordifoline和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的注释建立了I级置信水平。除配体3、7和13外，所有其他配体均已在同一水提物中被先前注释。

五、讨论总结

生物合成研究表明，Cluster A中注释的代谢物源于色胺和裂环马钱苷（secologanin）之间的曼尼希型缩合，产生斯特里托西丁（8）作为中心生物合成中间体。配体8和6之间的质量差（Δm = 14.014 Da）对应于CH₂单元，提示甲基化。配体8和4之间的质量差（Δm = 43.989 Da）与羧基的掺入一致。斯特里托西丁（8）也被报道经历构象重排后形成内酯。随后的生物合成转化，包括还原、消除和糖苷水解，可产生半缩醛中间体，进一步水解生成醛和醇。

在所鉴定的配体中，1、4、6、8和10被归类为单萜吲哚生物碱（MIAs），配体2、5和9被归类为内酯型MIAs，配体3、7和13被暂定为生物碱，配体11和12被鉴定为黄酮类化合物，配体14被注释为β-咔啉生物碱。这一化学分类与AS-MS结果一致，显示MIAs和结构相关的生物碱在AChE配体中明显占主导地位。其中，lyaloside（1）和10-羟基盖斯西唑（2）表现出最高的亲和比（AR值分别为3.73 ± 1.50和3.69 ± 2.06），表明与酶存在强相互作用。高AR配体（1–4）观察到的较高标准误差（SE_R）是高靶标选择性的分析结果而非实验缺陷，因为这些配体在失活对照上的保留极小，产生接近仪器检测限的低强度信号。

文献报道了吲哚核心对于AChE结合的相关性。来自萝芙木属（Rauvolfia）物种的MIAs研究表明，N-甲基化等结构特征可能影响AChE抑制活性，对接分析提示与Trp86和Trp133等残基存在π–π和疏水相互作用。AChE配体识别通常与活性位点峡谷内的π–π相互作用和氢键结合相关，该峡谷包含催化活性位点（CAS）和外周阴离子位点（PAS）。

六、研究结论翻译

使用亲和选择质谱（AS-MS）平台，将乙酰胆碱酯酶固定于磁性颗粒上，通过LC-HRMS从佩氏马钱（S. peckii）水提物中选择性捕获并鉴定了酶结合代谢物。十四种化合物达到加兰他敏亲和比截止值并被注释为AChE配体，其中单萜吲哚生物碱明显占主导地位，包括斯特里托西丁MIAs、MIA内酯和黄酮类化合物，与马钱属已知的神经活性化学性质一致。若干配体先前已被报道为AChE抑制剂，验证了AS-MS方法并扩展了与AChE结合剂相关的化学空间。结构注释得到了高分辨率MS/MS数据、分子网络、in silico去重复化以及四种选定代谢物的正交色谱和光谱确认的支持。总体而言，结果表明AS-MS是一种稳健且高效的策略，无需大量分级分离即可直接从复杂天然基质中优先筛选生物活性分子，并提供了佩氏马钱（S. peckii）中AChE配体的首次系统概述，支持其在民族药理学研究中的相关性以及对该物种的进一步药理学研究。