《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Rapsyn overexpression improves neuromuscular junction and skeletal muscle function after tourniquet-induced mouse hindlimb ischemia-reperfusion injuries
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止血带诱导的后肢缺血再灌注（tourniquet/IR）损伤可导致神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）中烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChR）簇的碎裂，并损害
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止血带诱导的后肢缺血再灌注（tourniquet/IR）损伤可导致神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）中烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChR）簇的碎裂，并损害神经控制的骨骼肌收缩功能。Rapsyn是一种胞质内nAChR相关蛋白，参与NMJ处nAChR的组装。本研究观察了rapsyn表达下调是否介导了小鼠后肢止血带/IR损伤所致的NMJ及骨骼肌结构损伤与功能障碍。研究人员对C57BL/6小鼠单侧后肢采用橡皮筋结扎实施3小时缺血，随后进行6周再灌注（止血带/IR）。通过向腓肠肌注射Ad-m-RAPSN以升高rapsyn水平，采用LV-m-Rapsyn shRNA敲低rapsyn表达。在假手术处理或止血带/IR后6周，评估骨骼肌收缩力、终板电位（endplate potentials, EPPs）及NMJ形态。与假手术小鼠相比，止血带/IR小鼠腓肠肌中NMJ显著碎裂且rapsyn表达降低，EPP幅度和肌肉收缩力亦下降。向止血带小鼠转染Ad-m-RAPSN可增加rapsyn表达，减少碎裂NMJ比例（38.2% ± 4.0%，对比单纯止血带/IR组的74.7%，P < 0.05），并提高EPP幅度和骨骼肌收缩力。相反，在正常小鼠中通过rapsyn shRNA下调rapsyn表达可导致NMJ碎裂和神经肌肉功能障碍。这些数据表明，止血带/IR降低了骨骼肌中rapsyn的表达，从而导致nAChR簇碎裂并损害骨骼肌收缩功能。Rapsyn过表达可能成为改善止血带/IR损伤后NMJ形态与功能恢复以及骨骼肌收缩功能的一种治疗策略。
论文解读
一、研究背景与目的
骨骼肌遍布全身，其收缩为机体所有运动提供稳定性和动力。骨骼肌需要运动神经支配才能产生收缩或维持肌张力以避免肌肉萎缩。神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）是连接运动神经元与骨骼肌纤维的特化突触结构。在脊椎动物中，肌纤维含有特化的膜区域即运动终板，烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChR）在此处高密度聚集。运动神经元释放的乙酰胆碱（Ach）与骨骼肌纤维细胞膜上的nAChR结合，产生局部去极化即终板电位（endplate potentials, EPPs）。正常情况下，神经肌肉传递高度可靠，单次EPP即可达到动作电位产生的阈值并最终引发肌肉收缩。NMJ中nAChR在突触后膜高密度聚集形成安全机制，确保每次神经冲动引起的突触后膜过度去极化能保证骨骼肌收缩的发生。多种关键骨骼肌相关NMJ组织蛋白参与nAChR簇形成，如agrin、LrP4、MuSK、DoK7和rapsyn等。其中，rapsyn作为支架蛋白，与nAChR结合并将其高密度聚集形成簇，这对有效的神经肌肉传递至关重要。Rapsyn不调控nAChR表达，但有助于nAChR在突触后膜上的稳定。
止血带常用于严重肢体出血的救治，常为挽救生命所必需。然而临床研究表明，止血带应用及随后释放（止血带/IR）会破坏NMJ结构、损害NMJ和骨骼肌功能，甚至导致完全性肢体瘫痪和继发性截肢。这些并发症导致临床止血带使用受到限制。目前针对止血带/IR骨骼肌损伤中NMJ组织分子的研究很少。尽管既往研究报道地塞米松治疗可促进止血带/IR损伤小鼠模型中NMJ和骨骼肌的功能恢复，但地塞米松因严重副作用不能长期使用。因此，探索止血带/IR损伤的机制并寻找潜在治疗靶点，对于改善伴有止血带/IR并发症的肢体创伤患者的预后和生活质量至关重要。本研究旨在探讨rapsyn表达下调是否参与止血带/IR中NMJ和骨骼肌的形态损伤与功能障碍，以确定rapsyn是否可作为改善止血带/IR损伤后NMJ和骨骼肌功能的关键治疗靶点。
二、研究内容与结论
研究人员采用雄性C57BL/6小鼠（10周龄，体重22–25 g），在麻醉下将正畸橡皮筋置于左后肢髋关节处以阻断后肢血流，实施3小时单侧后肢缺血后释放橡皮筋启动再灌注，持续6周。假手术小鼠除不实施缺血外接受相同操作。在再灌注第2周开始时，向止血带/IR小鼠腓肠肌注射Ad-m-RAPSN cDNA以过表达rapsyn，向正常小鼠注射LV-m-Rapsyn shRNA以敲低rapsyn。再灌注6周后评估骨骼肌收缩力、EPPs、NMJ形态及运动协调功能。
研究得出以下主要结论：止血带/IR导致骨骼肌中rapsyn表达降低，进而引起nAChR簇碎裂并损害骨骼肌收缩功能；Rapsyn过表达可部分改善止血带/IR损伤后NMJ的形态与功能恢复以及骨骼肌收缩功能。该发现提示rapsyn上调可能成为改善止血带/IR损伤后NMJ和骨骼肌功能恢复的潜在治疗策略，具有临床转化潜力。
三、主要关键技术方法
本研究采用小鼠后肢止血带/IR模型，使用激光多普勒散斑成像系统确认缺血再灌注。通过腺病毒介导的Ad-m-RAPSN基因局部注射实现rapsyn过表达，通过慢病毒介导的LV-m-Rapsyn shRNA实现rapsyn敲低。采用在体电生理记录技术检测坐骨神经刺激下的EPPs和腓肠肌强直收缩力；采用免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察NMJ形态，以α-银环蛇毒素标记nAChR簇、抗神经丝蛋白200和突触素标记神经末梢、抗rapsyn抗体标记rapsyn；采用Western blot检测rapsyn蛋白表达水平；采用转棒实验评估动物运动协调功能。
四、研究结果
- 1.
止血带/IR导致神经肌肉接头碎裂
再灌注6周后，止血带/IR小鼠腓肠肌中NMJ呈现显著碎裂的nAChR簇且rapsyn表达降低。Rapsyn与nAChR在腓肠肌中共定位，在损伤肌肉中呈现与nAChR簇相似的碎裂形态。与假手术组相比，止血带/IR小鼠每个nAChR簇的碎片数和碎裂NMJ比例显著增加（8.5% ± 0.8%和74.1% ± 6.1%，P < 0.05）。虽然每个nAChR簇的总面积未改变，但每个碎片的面积显著减小。止血带/IR显著降低了坐骨神经刺激的EPP幅度（18.2 ± 0.9 mV对比假手术组27.6 ± 0.7 mV，P < 0.05）和肌肉收缩力（50 Hz、100 Hz和150 Hz刺激下分别为45.8 ± 3.5 g、81.4 ± 5.0 g和86.0 ± 6.0 g，对比假手术组77.8 ± 3.4 g、109.3 ± 2.0 g和112.4 ± 2.2 g）。转棒实验显示止血带/IR降低了动物在加速旋转棒上停留的能力。
- 2.
Rapsyn过表达改善损伤肌肉中NMJ的恢复
向止血带/IR损伤的腓肠肌局部转染Ad-m-RAPSN基因可增加rapsyn表达（较Ad对照转染组升高2.9倍），并减轻nAChR簇的形态损伤。每个nAChR簇的碎片数和碎裂NMJ比例显著降低（4.1% ± 0.1%和38.2% ± 4.0%，P < 0.05对比止血带/IR组），每个碎片的面积显著增加。Rapsyn过表达还改善了NMJ功能，表现为坐骨神经刺激的EPP幅度升高（22.3 ± 1.5 mV，P < 0.05对比单纯止血带/IR组）。然而，损伤NMJ的结构和功能未完全恢复至假手术水平。值得注意的是，rapsyn过表达仅在50 Hz低频刺激下显著增加了骨骼肌收缩力（67.9 ± 4.1 g，P < 0.05），而在100 Hz和150 Hz高频刺激下无显著改善。转棒实验中肌肉收缩功能呈改善趋势但无统计学显著性。
- 3.
Rapsyn敲低损害神经肌肉功能
为明确rapsyn在NMJ形态和功能中的作用，研究人员使用慢病毒递送的rapsyn shRNA敲低正常腓肠肌中的rapsyn表达。Rapsyn敲低后，每个nAChR簇的碎片数和碎裂NMJ比例显著增加（4.6% ± 0.4%和41.9% ± 5.8%，对比对照组1.8% ± 0.1%和2.4% ± 1.0%，P < 0.05），每个碎片的面积显著减小。Rapsyn敲低降低了坐骨神经刺激的EPP幅度（22.3 ± 0.6 mV对比对照组26.9 ± 0.7 mV，P < 0.05），并减弱了肌肉收缩功能。有趣的是，rapsyn敲低对50 Hz低频刺激诱导的肌肉收缩影响较小，但显著损害了高频刺激诱导的肌肉收缩。Rapsyn敲低未改变NMJ中的运动神经支配和终末占据率。
五、讨论与结论
研究人员发现止血带/IR后腓肠肌中rapsyn蛋白水平降低，伴随nAChR簇碎裂、EPP幅度和肌肉收缩力下降。在损伤肌肉中过表达rapsyn可促进NMJ结构和功能以及骨骼肌收缩的恢复；而在正常肌肉中敲低rapsyn可模拟止血带/IR效应，导致nAChR簇碎裂和NMJ及骨骼肌功能障碍。这些结果证实rapsyn蛋白水平降低参与了止血带/IR损伤骨骼肌中nAChR簇损伤和NMJ功能障碍。
Rapsyn在突触后膜nAChR聚集和NMJ维持中发挥关键作用。Rapsyn可聚集nAChR并延长其在细胞膜上的半衰期。在rapsyn缺陷小鼠中，由于突触后膜nAChR密度降低，突触活动减弱。Rapsyn过表达可稳定运动终板中的nAChR，促进nAChR从胞质向细胞膜转运，并在自身免疫性重症肌无力动物模型中防止nAChR丢失。
研究还发现，rapsyn过表达仅 rescued 低频（50 Hz）而非高频（100和150 Hz）神经刺激诱导的损伤骨骼肌收缩，而rapsyn敲低显著损害高频而非低频刺激诱导的肌肉收缩。研究人员推测完整的NMJ结构对于高频神经刺激触发的强肌肉收缩更为关键。
尽管rapsyn过表达改善了止血带/IR小鼠的NMJ传递和坐骨神经刺激的腓肠肌收缩，但在清醒动物的转棒实验中仅带来趋势性而非显著性的改善。研究人员认识到转棒实验通常用于评估运动和骨骼肌协调功能，涉及参与运动活动的所有骨骼肌。可能的原因是rapsyn过表达仅限于腓肠肌而非整个止血带/IR损伤的单侧后肢肌肉。
关于rapsyn下调的机制尚不清楚。既往研究报道Wnt3a激活的β-catenin可降低rapsyn表达并抑制nAChR聚集。研究人员的预实验也发现止血带/IR增加了骨骼肌中β-catenin蛋白表达。因此，β-catenin过表达可能负性调控rapsyn转录以减少止血带/IR小鼠中rapsyn蛋白表达。另一种可能是rapsyn蛋白的泛素化降解导致其在止血带/IR小鼠中下调。
本研究的局限性在于Ad-m-RAPSN转染并非仅限于骨骼肌纤维。虽然外源性Ad-m-RAPSN转染可能诱导运动轴突中rapsyn表达，但不影响NMJ中的运动神经支配和终末占据率。
综上所述，止血带/IR通过降低rapsyn蛋白导致nAChR簇碎裂并损害神经肌肉传递和骨骼肌收缩。Rapsyn蛋白过表达可减轻止血带/IR诱导的NMJ和骨骼肌功能障碍。鉴于本研究在止血带/IR后第2周初在损伤骨骼肌中过表达rapsyn，研究人员认为止血带/IR后上调rapsyn将作为改善止血带/IR损伤后NMJ和骨骼肌功能长期恢复的潜在治疗策略，具有临床相关性和转化潜力。
