抗体多变体快速表达纯化全流程指南与实践

　　

抗体多变体快速表达纯化全流程指南与实践

抗体工程化改造后，研发人员往往面临数十至数千条变体序列需要快速验证的挑战。基于无细胞蛋白合成（CFPS）技术的高通量表达纯化方案，有助于将传统细胞表达所需的数天周期压缩至数小时，义翘神州自主研发的XPressMAX™无细胞蛋白合成平台为这一需求提供了从DNA到功能蛋白的全流程解决路径。

抗体工程化改造面临的核心挑战

多变体并行验证的效率瓶颈是抗体工程化改造中的关键问题。在CDR区饱和突变、定点突变或组合突变等改造策略下，可产生数十至数百个需独立验证的候选变体。然而，常规蛋白表达流程受限于细胞培养与转染周期，单轮验证往往耗时数天乃至更长，这直接制约了筛选效率。其在AI驱动的抗体设计场景下，算法可在短时间内生成成百上千条候选序列，而湿实验验证能力若无法匹配算法速度，将成为整个研发链条的限速步骤。

表达成功率与样品质量的平衡同样值得关注。工程化改造后的抗体变体可能包含非天然序列或复杂二硫键结构，部分变体在传统细胞体系中可能出现表达困难或折叠异常的情况。因此，选择一个对难表达蛋白友好、且能维持高成功率的表达体系，对于提升筛选效率具有重要意义。

无细胞蛋白合成系统的技术优势

无细胞蛋白合成系统无需依赖活细胞，在体外直接完成转录与翻译过程。该技术已有70多年的发展历史，能够稳定表达抗体及其片段、结合型小蛋白、活性蛋白等多种类型的蛋白。其核心优势体现在以下方面：

1. 极速表达周期。 由于突破了细胞生长和代谢的限制，CFPS体系可在数小时内完成蛋白合成，将重组表达过程从"天"级提升至"小时"级。义翘神州XPressMAX™试剂盒从DNA模板加入到蛋白产出可在2至6小时内完成，最佳反应时间为3小时，可依据蛋白本身特性进行调整。

2. 高通量兼容性。 CFPS体系天然适配96孔、384孔等多孔板反应体系，易于微型化并整合自动化液体处理平台，实现大规模并行化实验操作。义翘神州的无细胞表达服务单个项目可支持超过2000个抗体的高通量生产。

3. 难表达蛋白的成功制备。 义翘神州利用无细胞蛋白合成系统，已有在真核细胞中不表达的抗体片段的成功制备案例。针对含复杂二硫键的目的蛋白，XPressMAX™体系无需额外添加增强剂即可实现高效正确折叠。

多变体快速表达纯化的操作策略

在具体实施抗体多变体并行表达纯化时，以下策略有助于提升流程效率：

模板制备阶段。 XPressMAX™试剂盒支持质粒与线性DNA（PCR产物）作为模板，可跳过传统分子克隆步骤。义翘神州针对无细胞表达质粒专门开发了即用型载体（CFV001）和高纯度质粒提取工艺，有助于实现蛋白高产率和批次间一致性。

反应体系配置。 根据实验目的选择合适的反应体积：100 μL标准体系适用于上清直接检测的高通量筛选场景；500 μL反应体系建议用于蛋白纯化，通常能获得更高的纯化效率。反应条件为30℃摇床、100至130 rpm振荡反应。

标签选择与纯化。 分子构建时推荐使用10×His tag，相比6×His tag的挂柱结合效率更高，产量大概会高5至10倍。该体系同时兼容Strep II标签。对于500 μL反应体系，对应使用50至100 μL NTA-Ni磁珠或填料进行纯化。

质量评估。 根据义翘神州已有项目数据，利用该无细胞蛋白合成系统表达的VHH可达到SDS-PAGE和SEC-HPLC纯度均大于95%的水平，且制备的抗体片段显示出与哺乳动物细胞表达纯化样品一致的体外抗原结合活性。

与AI驱动研发的闭环整合

在AI抗体药物发现场景中，XPressMAX™平台的高通量特性有助于构建从计算设计到功能验证的快速迭代闭环。据义翘神州公开资料显示，该平台可在1至2周完成3000多个VHH饱和突变的合成和ELISA检测，经两轮筛选即获得亲和力提升一个数量级的优势突变体，为抗体亲和力成熟提供快速解决方案。另外，平台整体表达成功率达99%以上，VHH/scFv抗体片段的上清浓度可达 143 μg/mL 以上，纯化浓缩后的蛋白浓度可达 0.65 mg/mL。

此外，义翘神州还提供20余种抗体可开发性评估方法，可进一步快速分析AI设计序列的可行性，形成AI抗体研发验证闭环。

常见问题

Q1：无细胞表达系统适合哪些抗体片段类型的多变体筛选？

A1：义翘神州XPressMAX™平台已验证的成功表达类型涵盖多种形式的VHH和scFv（单价VHH、VHH-Linker-VHH、scFv-His等）、Fab与Fc形式（包括VHH-Fc二聚体及人源、鼠源单抗的Fab片段），以及Miniprotein等，成功率超99%。

Q2：无细胞表达的抗体活性是否与细胞表达体系一致？

A2：义翘神州已有项目数据表明，无细胞系统表达纯化的VHH结合活性与HEK293细胞表达的相当，SDS-PAGE和SEC-HPLC纯度均大于95%。在特定条件下，该体系还可实现传统细胞中表达困难的抗体片段的成功制备。

Q3：如何选择高通量筛选与纯化的反应体积？

A3：义翘神州XPressMAX™试剂盒建议100 μL反应体积用于高通量筛选（可在96平底细胞培养板中操作），500 μL以上反应体积用于需要纯化的场景。分子构建时推荐使用10×His tag，相比6×His tag产量可提高约5至10倍。

Q4：从DNA模板到获得纯化抗体样品的整体周期是多少？

A4：义翘神州无细胞表达平台从DNA到蛋白快至5天交付，其中蛋白表达环节3小时即可完成，快至1天即可拿到纯化样品。对于AI驱动的大规模筛选项目，从DNA到AI Ready数据最快3天完成交付。