大麦EMS突变体叶片斑驳由两个上位性突变控制且候选基因涉及叶绿体蛋白质稳态

《Theoretical and Applied Genetics》：Leaf variegation in a barley EMS mutant is controlled by two epistatic mutations

关键信息：研究人员在大麦突变体中发现叶片斑驳由双基因控制；通过全基因组重测序鉴定的候选基因，与叶绿体蛋白质稳态（proteostasis）的可能作用一致。

摘要：斑驳突变体为叶绿体生物发生提供了重要见解。研究人员对一个新鉴定的大麦斑驳突变体进行了特征分析，其表型由两个上位性隐性基因控制。因果位点var4和var5分别定位于2H和3H染色体。研究人员利用基因分型测序（genotyping-by-sequencing，GBS）、连锁作图和PACE基因分型，随后通过全基因组重测序鉴定候选基因。两个首选候选基因分别编码一个类NBR1选择性自噬受体基因和一个含DNAJ结构域的基因。基于同源性的功能注释，两个候选基因都可能参与叶绿体蛋白质稳态，调控蛋白质的导入、折叠和/或降解。虽然功能验证仍有必要，但每个突变对蛋白质稳态造成的轻微、独立缺陷可能协同作用，超过功能阈值，从而损害早期叶片的叶绿体发育，同时允许后期部分恢复。这些发现揭示了大麦斑驳性状的一种新型双基因遗传基础，并鉴定了与叶绿体蛋白质稳态相关的候选基因和通路。

自20世纪50年代以来，诱变群体一直被用于创制新性状或通过表型缺陷解析发育过程的遗传基础。光合相关突变体常表现异常叶色，是研究叶绿体发育的重要材料。叶绿体生物发生需要核基因组与质体基因组协同调控，约3000个叶绿体蛋白中仅不到100个由质体基因组编码，因此多数叶色异常突变定位于核基因。斑驳突变体因叶片同时存在绿色和色素缺陷区域，且通常能存活并结籽，比白化突变体更适合遗传研究。目前已克隆的斑驳基因包括拟南芥的VAR1/VAR2（编码FtsH金属蛋白酶）以及大麦的albostrians、luteostrians和grandpa1.a等。在此基础上，研究人员对一例新鉴定的大麦斑驳突变体进行遗传解析，发现其斑驳性状由两个上位性基因控制；这是叶绿素缺陷突变体首次报道双基因控制，为理解叶绿体蛋白质稳态与发育调控提供了新线索。

研究人员以EMS诱变的大麦品种Igri的M₄代突变体为材料，构建Alraune与突变体的正反交群体AM、MA及Igri与突变体的回交群体IM。通过表型分离分析、遗传连锁作图、PACE基因分型和全基因组鸟枪法测序（WGS），将var4定位在2H染色体、var5定位在3H染色体；在两个区间内各筛选出5个候选基因，其中最优候选分别编码类NBR1选择性自噬受体和含DNAJ结构域的分子伴侣。研究人员还利用透射电镜（TEM）观察叶绿体超微结构，发现白色条纹区域叶绿体发育受阻，后期黄色条纹区域出现部分恢复。这些结果表明，两个位点的突变可能各自造成轻微的蛋白质稳态缺陷，组合后超过功能阈值，最终导致斑驳表型。

关键技术方法如下：研究人员利用40 mM EMS处理大麦品种Igri获得M₄突变体，构建Alraune×突变体正反交群体（AM、MA）以及Igri×突变体回交群体（IM）；通过表型鉴定和透射电镜分析叶绿体超微结构；采用基因分型测序（GBS）和连锁作图将var4、var5分别定位在2H、3H染色体；利用PACE基因分型验证定位区间；对30份IM F₂个体进行全基因组鸟枪法测序（WGS），以Morex和Igri基因组为参考鉴定候选基因；最后通过同源检索和氨基酸保守性分析评估候选基因。

研究结果分述如下：

（1）斑驳表型的描述与分离：突变体叶片呈现白色条纹，严重程度从近白苗到少量窄白条纹不等；随着植株生长，条纹在约6个月后逐渐变黄。AM和MA正反交群体的斑驳株比例分别为17/298和6/203，统计检验无显著差异，表明该性状由核基因控制，不存在明显的母性遗传。合并群体的分离比符合1:15，说明斑驳表型需要两个隐性上位基因同时纯合突变；6个斑驳F₂植株的F₃后代全部表现斑驳，证实其基因型在相关位点已纯合固定。

（2）遗传定位揭示两个上位性位点：对AM和MA群体进行GBS基因分型和连锁作图，检测到2H和3H两个主效位点，分别命名为var4和var5。var4区间位于chr2H约118,301,256–545,212,322 bp，var5区间位于chr3H约145,112,389–450,737,461 bp。基因型与重组事件分析表明，只有两个位点均为突变体纯合时植株才表现斑驳；PACE基因分型验证了定位区间，但未进一步缩小范围。

（3）每个区间各有五个候选基因：对回交群体IM中30个F₂个体进行WGS，结合突变效应预测，var4和var5区间分别得到5个候选基因。var4的最优候选是HORVU.MOREX.PROJ.2HG00154410，编码NBR1类蛋白；该突变将甘氨酸替换为天冬氨酸，位于锌指结构域上游连接区，可能影响其结合效率。var5的最优候选是HORVU.MOREX.PROJ.3HG00238870，编码DNAJ结构域分子伴侣；突变将高度保守的丝氨酸替换为苯丙氨酸，位于DUF3444结构域内。其他候选基因包括phytochrome kinase substrate 4同源蛋白和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶同源蛋白，但突变保守性较差；另有上游非编码区EMS型突变，不能完全排除调控效应。

（4）双突变体的叶绿体超微结构：14日龄白条纹区域叶绿体明显偏小，存在原片层体，类囊体发育不良且缺乏基粒垛叠，表明叶绿体生物发生受阻；绿色区域叶绿体发育正常。6个月后，黄色条纹区域内部分质体出现较规则的类囊体和少量小基粒，但仍远不如绿色区域发达，提示叶绿体发育在后期发生部分恢复。

讨论部分指出，斑驳性状的双基因控制可用两个突变效应的叠加以及阈值依赖机制解释，类似于拟南芥var2和大麦albostrians的模型。NBR1类蛋白与DNAJ蛋白均可能参与叶绿体蛋白质稳态：NBR1介导受损叶绿体的自噬清除并调控TOC复合物丰度，DNAJ蛋白作为Hsp70辅伴侣参与蛋白折叠和降解。两个突变单独作用可能仅造成轻微损伤，组合后足以扰乱叶绿体蛋白质稳态；由于质体蛋白质组随发育阶段变化，后期影响减弱，对应观察到的黄化恢复。研究结论可概括为：这些发现揭示了大麦斑驳性状的新型双基因遗传基础，并鉴定了与叶绿体蛋白质稳态相关的候选基因和通路；候选基因仍需功能验证。