《BMC Cancer》：Association of regulatory B, T cells and cytokine production with disease stage in non-small cell lung cancer patients: prospective case control study
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背景与目的：调节性B细胞（Bregs）与调节性T细胞（Tregs）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用研究甚少。因此，研究人员探讨了NSCLC患者循环Bregs、Tregs的频率及血清细胞因子谱，并分析其与疾病进展的关联。
材料与方法：本前瞻性病例对照研究纳入
背景与目的：调节性B细胞（Bregs）与调节性T细胞（Tregs）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用研究甚少。因此，研究人员探讨了NSCLC患者循环Bregs、Tregs的频率及血清细胞因子谱，并分析其与疾病进展的关联。
材料与方法：本前瞻性病例对照研究纳入40例NSCLC患者和40例健康对照者，采集外周血样本，采用流式细胞术评估包括Bregs和Tregs在内的多种淋巴细胞亚群频率；采用Luminex技术检测血清细胞因子谱，包括IL1β、IL6、IL-17、TNF‐α、IL10、IL35及TGF-β1。
结果：与健康对照相比，NSCLC患者中Bregs、Tregs、CD8?T细胞比例升高，CD4?/CD8?比值降低。伴有远处转移的NSCLC患者其Bregs和Tregs频率高于无转移患者。Bregs和Tregs的频率与疾病分期及组织病理学状态相关。NSCLC患者血清细胞因子水平显著高于健康对照，并与淋巴结转移及不同TNM分期显著相关。
结论：NSCLC患者外周血Bregs、Tregs及血清细胞因子谱（包括促炎和抗炎细胞因子）均升高，可能与疾病进展和转移相关。
论文解读文章
一、研究背景与立题依据
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中约85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。近年来，免疫系统在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视，免疫治疗已在多种癌症中获得临床应用和监管批准。NSCLC能够逃避特异性主动抗肿瘤免疫应答，这一免疫逃逸机制是肿瘤进展的关键环节。
调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）在多种疾病中发挥免疫稳态调节作用，并可通过释放细胞毒性颗粒干扰细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的功能，从而抑制抗肿瘤免疫应答。Foxp3?Tregs在NSCLC中的预后意义存在争议。调节性B细胞（regulatory B cells，Bregs）是新近发现的B细胞亚群，可通过产生IL-10和/或TGF-β下调炎症反应并诱导免疫耐受，同时与致病性T细胞相互作用以阻止有害免疫应答。IL-35可由Tregs和Bregs产生，以增强Tregs的抑制功能，并可诱导Bregs分泌IL-10和IL-35。本研究聚焦于未成熟/过渡性B细胞表型CD19?CD24?highCD38?high，该亚群以高水平产生抗炎细胞因子IL-10为特征，可抑制T细胞增殖。
目前，Bregs和Tregs在NSCLC中的循环频率及其与疾病分期、转移状态和细胞因子谱的关联研究仍较缺乏。本研究旨在分析NSCLC患者循环Bregs和Tregs的频率及血清细胞因子谱（包括促炎和抗炎细胞因子），并探讨其与疾病进展的关联。
二、研究设计与主要技术方法
本研究为前瞻性病例对照研究，纳入2021年1月至12月期间在埃及Sohag大学医院胸科和临床肿瘤科招募的40例NSCLC患者和40例年龄、性别匹配的健康对照者。患者均经临床检查、常规实验室检查、胸部X线和CT扫描、腹部/盆腔/脑部CT或脑MRI、骨闪烁显像及纤维支气管镜活检确诊，采用AJCC第八版TNM分期系统进行临床分期。排除标准包括胸部感染、结核、心脏病、肾或肝功能不全、活动性消化道出血、消化性溃疡病史、其他部位恶性肿瘤及既往接受过肺癌治疗者。
主要技术方法包括：（1）流式细胞术检测T淋巴细胞亚群及Tregs，使用FITC标记CD3、PE标记CD8和CD4抗体，Tregs以CD4?CD25?highFoxp3?表型鉴定；（2）流式细胞术检测Bregs，以CD19?CD24?highCD38?high表型定义；（3）Luminex多重检测技术测定血清细胞因子IL1β、IL6、IL-17、TNF‐α、IL10、IL35和TGF-β1浓度；（4）统计学分析采用Mann-Whitney检验、Spearman相关分析及单因素和多因素logistic回归分析。
三、研究结果
1. 淋巴细胞亚群、Tregs和Bregs在NSCLC患者中的变化
与健康对照组相比，NSCLC患者CD8?T细胞频率显著升高（P=0.0001），CD4?/CD8?比值显著降低（P=0.0001），CD4?CD25high T细胞（P=0.002）和FoxP3（P=0.03）频率显著升高。NSCLC患者外周血Tregs显著高于健康对照（P=0.03），Bregs频率亦显著升高（P=0.0001）。CD25、CD25intermediate T细胞及CD19?B细胞频率在两组间无显著差异。
2. Bregs和Tregs与不同临床状态分类的关联
伴有远处转移的NSCLC患者（n=20）其Bregs（P=0.02）和Tregs（P=0.03）频率显著高于无转移患者（n=20）。
3. Bregs和Tregs与组织病理学状态的关联
按组织病理学分类（肺腺癌n=19、鳞状细胞癌n=14、未分化癌n=4、大细胞癌n=3），Bregs（P=0.02）和Tregs（P=0.01）频率与组织病理学类型显著相关，其中腺癌患者的Bregs和Tregs均显著升高。
4. Bregs和Tregs与不同TNM分期的关联
IV期NSCLC患者（n=20）的循环Bregs（P=0.02）和Tregs（P=0.04）显著高于III期（n=15）和II期（n=5）患者。此外，Bregs频率与Tregs频率呈显著正相关（r=0.37，P=0.01）。
5. 细胞因子谱水平
NSCLC患者所有检测的血清细胞因子水平均显著高于健康对照组（P<0.0001）。伴有远处转移的患者其IL10（P=0.04）、IL35（P=0.02）、IL6（P=0.02）、IL17（P=0.03）、TGFβ1（P=0.04）和TNF-α（P=0.03）水平显著高于无转移患者，IL1β除外。不同组织病理学类型间各细胞因子水平无显著差异。不同TNM分期患者间IL10（P=0.03）、IL6（P=0.03）、IL17（P=0.02）、TNF（P=0.01）和TGF（P=0.04）存在显著差异，而IL35和IL1β无显著差异。
6. 回归分析
单因素logistic回归分析显示，Bregs与淋巴结受累显著负相关（OR=0.662，95% CI：0.444–0.987，p=0.043）；CD8?T细胞与高级别肿瘤显著负相关（OR=0.923，95% CI：0.853–0.998，p=0.045）；CD4/CD8比值与高级别肿瘤显著正相关（OR=14.385，95% CI：1.025–201.848，p=0.048）。多因素回归分析中，各免疫变量均未达到统计学显著，但Bregs、Tregs和CD4/CD8比值的OR方向一致且具有生物学合理性，淋巴结受累模型拟合度最佳（Nagelkerke R2=0.382）。
四、讨论与结论
研究人员发现NSCLC患者外周血Bregs（CD19?CD24hiCD38hi）和Tregs（CD4?CD25?Foxp3?）频率显著升高，且与远处转移、晚期TNM分期及腺癌组织学类型显著相关。Bregs与Tregs之间的正相关提示二者存在协同免疫抑制机制，可能通过细胞间接触及IL-10/IL-35分泌促进Foxp3和CTLA-4表达上调，从而增强肿瘤免疫逃逸。血清细胞因子谱中促炎因子（IL6、IL17、TNF-α）和抗炎因子（IL10、IL35、TGF-β1）同时升高，反映了肿瘤促进性炎症微环境与免疫抑制的协同作用。IL-35可导致CD8?T细胞功能障碍，TGF-β是NSCLC上皮-间质转化的最强促进因子。
研究局限性包括样本量较小（n=40）、缺乏I期病例以及观察性研究设计无法建立因果关系。但本研究采用无创性血液检测方法，为NSCLC诊断和疾病进展监测提供了潜在的替代生物标志物。
结论：NSCLC患者外周血Bregs、Tregs及血清细胞因子谱（包括促炎和抗炎细胞因子）均升高，并与NSCLC晚期阶段相关。循环Bregs和Tregs可能作为反映肿瘤微环境免疫改变的可行替代生物标志物，具有潜在的预后评估价值，需在更大规模的前瞻性队列中进一步验证。
